脱氧核糖核酸内切酶与细胞凋亡

哺乳动物细胞广泛存在细胞凋亡。脱氧核糖核酸内切酶 (DNase)在细胞凋亡中发挥重要作用 ,染色质DNA降解、浓缩及细胞核结构的破坏都与DNase有关。目前已发现多种DNase参与不同类型细胞的凋亡。本文重点对DNaseI、DNaseII、NUC18、NUC70、AN34、DFF (DFF4 0 /DFF4 5 )等内源性DNase与哺乳动物细胞凋亡的关系作系统的归纳和分析。

脱嘌呤/脱嘧啶脱氧核糖核酸内切酶1对模拟脓毒症状态下小鼠树突状细胞铁死亡的作用

目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶脱氧核糖核酸内切酶1(APE1)对模拟脓毒症状态下小鼠树突状细胞(DC)铁死亡的作用,为改善创面感染等引起的脓毒症免疫抑制提供依据。方法该研究为实验研究。取第3~10代对数生长期的小鼠DC系DC2.4进行研究(样本数均为3),采用1μg/mL内毒素/脂多糖(LPS,浓度下同)处理DC 0(未处理)、6、12、24、48、72 h构建脓毒症模型,采用蛋白质印迹法检测细胞中APE1及抗铁死亡蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)蛋白表达,采用流式细胞术检测细胞中活性氧水平,采用活细胞成像技术检测细胞脂质过氧化水平;将成功转染含APE1基因短发夹RNA序列慢病毒的DC分为敲减APE1+磷酸盐缓冲液(PBS)组、敲减APE1+LPS组,将成功转染空载慢病毒的DC分为空载体+PBS组、空载体+LPS组,给予PBS或LPS刺激并培养24 h后同前行相应检测;将成功转染含APE1基因过表达RNA序列慢病毒的DC分为过表达APE1+PBS组、过表达APE1+LPS组,将成功转染空载慢病毒的DC分为空载体+PBS组、空载体+LPS组,给予PBS或LPS刺激并培养24 h后同前行相应检测。将88只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为玉米油+假伤组、玉米油+盲肠结扎穿孔(CLP)组、抑制剂+假伤组、抑制剂+CLP组,每组22只。对2个抑制剂组小鼠按照40 mg/kg每日灌胃1 mg/mL APE1抑制剂E3330,对2个玉米油组小鼠每日灌胃等量玉米油,2周后对2个CLP组小鼠行CLP术构建脓毒症模型,对2个假伤组小鼠行假手术。从4组小鼠中各选取16只,观察术后7 d内存活情况;术后24 h采用CD11c阳选磁珠提取4组分别剩余的6只小鼠脾脏DC同前行相应检测(样本数均为3)。结果与LPS处理0 h比较,LPS处理6 h时细胞中APE1蛋白表达显著升高(P<0.05),LPS处理24、48、72 h时细胞中APE1与GPX4蛋白表达及LPS处理24 h时细胞中SLC7A11蛋白表达均显著降低(P<0.05),LPS处理24、48、72 h时细胞中活性氧水平(P<0.05)与细胞脂质过氧化水平均显著升高。培养24 h后,敲减APE1+LPS组细胞中GPX4蛋白表达较敲减APE1+PBS组显著降低(P<0.05),细胞中活性氧水平(P值均<0.05)及细胞脂质过氧化水平显著高于敲减APE1+PBS组与空载体+LPS组。培养24 h后,过表达APE1+LPS组细胞中APE1、SLC7A11、GPX4蛋白表达均较空载体+LPS组显著升高(P<0.05),细胞中活性氧水平(P<0.05)及细胞脂质过氧化水平显著低于空载体+LPS组。术后24 h,抑制剂+CLP组小鼠细胞中APE1与GPX4蛋白表达水平均显著低于抑制剂+假伤组、玉米油+CLP组(P<0.05);玉米油+CLP组小鼠细胞中活性氧水平(12693±913)显著高于玉米油+假伤组(4205±805,P<0.05),抑制剂+CLP组小鼠细胞中活性氧水平(18085±223)显著高于抑制剂+假伤组(4381±787)和玉米油+CLP组(P值均<0.05);抑制剂+CLP组小鼠细胞脂质过氧化水平显著高于抑制剂+假伤组与玉米油+CLP组。术后7 d内,抑制剂+CLP组小鼠存活比显著低于抑制剂+假伤组(χ^(2)=22.67,P<0.05)。结论模拟脓毒症状态下,小鼠DC中APE1表达降低,氧化应激及铁死亡增强;敲减APE1会加重DC铁死亡,过表达APE1则有效减轻DC铁死亡;抑制DC中APE1表达与脓毒症预后不良密切相关。

作用于cip-cel mRNA的核糖核酸内切酶的鉴定

【目的】本研究以革兰氏阳性细菌解纤维素梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum)为研究对象,筛选作用于纤维小体编码基因簇cip-cel mRNA的核糖核酸内切酶。【方法】通过对预测的4个假定编码核糖核酸内切酶基因进行基因敲除、体内过表达、体外过表达和活性分析等方法,分析它们对cip-cel mRNA剪切位点的剪切能力。【结果】敲除rnc和rnj基因,对cip-cel mRNA剪切没有任何影响;体内过表达RNase时能够加速cip-cel mRNA的降解,而过表达RNase G时,则结果与野生型对照菌株无异;RNase G基因rng和RNase Y基因rny的体外活性鉴定分析,发现RNase G对体外转录的包含cip-cel mRNA剪切位点的RNA没有作用,而RNase Y能够对其进行剪切和降解。【结论】RNase Y是能够作用于cip-cel mRNA的核酸内切酶。该研究结果对理解革兰氏阳性细菌核糖核酸内切酶的作用机制,及其在转录后水平的调控基因差异表达等方面具有重大意义。

人乳头瘤病毒DNA的限制性核酸内切酶分析

用差速离心和CsCl平衡密度梯度离心法,从收集的寻常疣中分离并纯化了人乳头瘤病毒(HPV),从中抽提病毒DNA,经四种限制性核酸内切酶消化后,其消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示EcoRI,BamHI,HindⅡ,HindⅢ分别将环形的HPV DNA裂解成1、2、3、2个片段,同时以λDNA的HindⅢ片段为标准核酸计算了各HPV DNA片段的分子量。

降低lncRNA-RMRP表达抑制人肺癌细胞系A549的增殖和侵袭

目的探讨抑制线粒体RNA加工核糖核酸内切酶RNA组分(RMRP)表达对人肺癌细胞系A549增殖和侵袭的影响;检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者全血和组织中RMRP表达,比较在不同临床指标表达差异性,以期为NSCLC机制研究提供参考资料。方法收集2016年3月至2021年3年在焦作市人民医院行手术治疗的NSCLC患者122例,同期,在体检中心选取健康者50名作为对照组。RT-qPCR检测全血和组织中RMRP mRNA水平。培养A549细胞分为si-RMRP组、siRNA-NC组和空白组(blank组)。RT-qPCR、CCK-8法和Transwell小室法分别检测细胞中RMRP表达、增殖活性和侵袭细胞数。结果NSCLC患者全血中RMRP相对表达量显著高于对照组(P<0.001);NSCLC组织中RMRP相对表达量高于癌旁组织(P<0.001);低分化、淋巴结转移和TNM分期Ⅲ的NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量较高分化、未发生淋巴结转化和TNM分期Ⅰ~Ⅱ明显升高(P<0.05);Si-RMRP组细胞中RMRP相对表达量低于空白组(blank组)和siRNA-NC组(P<0.001);相比与blank组和siRNA-NC组,24、48、72和96 h时si-RMRP组细胞吸光度(A)值均降低(P<0.05);Si-RMRP组细胞侵袭数低于blank组和siRNA-NC组(P<0.001)。结论NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量升高,下调A549细胞中RMRP基因表达可抑制细胞增殖,减少细胞侵袭。

糖核酸内切酶Ⅲ制备的小干扰RNA(esiRNA)文库对乙肝病毒感染的基因治疗

目的建立HBV esiRNA文库并研究该文库对HepG2.215细胞内HBV表面抗原(HBsAg)表达的抑制效应。方法制备并纯化大肠杆菌核糖核酸内切酶ⅢGST融合蛋白(GST-RNaseⅢ);设计并制备HBV基因组序列1～540核苷酸(HBV-1)的双向转录模板(T7-HBV-1);体外转录该模板获得双链RNA(dsRNA),即T7-HBV-1 dsR-NA;用GST-RNaseⅢ酶切T7-HBV-1 dsRNA制备HBV小干扰RNA文库(esiRNA library);应用50、100和150 nmol/L纯化的esiRNA文库转染携带HBV病毒的HepG2.215细胞并应用实时定量PCR及ELISA检测HBsAg的转录和蛋白翻译表达水平。结果成功制备并纯化有活性的GST-RNaseⅢ;用该酶将体外制备的dsRNA酶切并纯化得到esiRNA文库;应用该文库成功抑制了HepG2.215细胞内的HBV HBsAg的表达,并且其抑制作用随esiRNA浓度升高而增强。结论用生物学方法制备的HBV esiRNA文库可以成功抑制HBV HBsAg在细胞内的表达,为预防治疗HBV感染开辟了新的思路。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp11结构与功能

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种严重危害生猪养殖的重要病原,以引起感染母猪繁殖障碍和各日龄猪只呼吸道症状为特征。PRRSV病原具有免疫抑制、持续性感染和高度变异的特性,其在靶细胞（PAMs）中或体内的增殖能力能够直接影响病毒的致病性,而病毒编码的非结构蛋白（nsp）往往与病毒复制增殖能力密切相关。

禽传染性支气管炎病毒拮抗JAK-STAT信号通路的研究

已有报道显示冠状病毒拮抗干扰素下游JAK-STAT信号通路,然而,关于传染性支气管炎病毒(IBV)对JAK-STAT信号通路的拮抗,鲜有报道。本文通过Western blot试验,证实IBV感染抑制STAT1和STAT2的磷酸化;间接免疫荧光实验证实IBV和nsp15核酸酶活性缺陷型重组病毒rIBV-nsp15-H238A均能抑制STAT1的核转位,说明IBV感染确实拮抗JAK-STAT信号通路,且nsp15核酸酶活性不是必需的。进一步实验证明,IBV编码的核酸内切酶nsp15,能够抑制内源性和外源性的STAT1表达,并且nsp15的核酸酶活性位点及其三聚化能力都是必需的。由于nsp15缺陷型毒株rIBV-nsp15-H238A能够跟野生型IBV一样拮抗JAK-STAT信号通路,推测IBV还编码其他蛋白,作用于JAK-STAT信号通路,需要进一步对病毒蛋白进行筛选和研究。

猪RNase L与PRRSV nsp4缺失突变体的构建及其互作研究

RNase L是一种独特的核糖核酸内切酶,在机体的抗病毒过程中发挥重要作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白4(nsp4)具有3C样丝氨酸蛋白酶活性,是参与病毒多聚蛋白前体切割的主要蛋白酶,是影响病毒粒子成熟的重要蛋白。课题组前期研究发现猪RNase L(sRNase L)能够与nsp4互作发挥抗PRRSV作用。为了筛选sRNase L与nsp4互作的区段或位点,本研究分别构建了sRNase L与nsp4的截短体或突变体,通过免疫共沉淀试验进行筛选,结果显示突变体sRNase L R460A、sRNase L R675A、sRNase L Y720A、sRNase L F724A都能够与nsp4发生互作,只有缺失体sRNase L 1~586 aa不与nsp4互作,表明sRNase L第3结构域(587~744 aa)为与nsp4互作区段,但该区段不包括第675位精氨酸、第720位酪氨酸、第724位苯丙氨酸;分别包含nsp4三个结构域的截短体nsp4-D1(1~80 aa)、nsp4-D2(60~156 aa)、nsp4-D3(157~204 aa)中,只有nsp4-D1与sRNase L发生互作,表明nsp4的1~60 aa为与sRNase L互作区段。本研究为进一步探究sRNase L与nsp4互作抗PRRSV机制奠定了基础,为预防和控制PRRSV感染提供了新的思路和方法。

APE表达水平与胃癌临床病理因素的相关性分析

目的:研究胃癌患者不同胃黏膜组织无嘌呤无嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclase APE)的表达水平与临床病理因素的相关性。方法:利用已构建好的包含208例胃癌患者胃癌、正常胃黏膜和转移淋巴结的组织芯片,用免疫组化方法检测不同组织APE表达水平,结合患者的临床资料进行统计分析。结果:正常组织和转移淋巴结中细胞核、细胞质APE表达水平与临床各病理因素之间没有明确相关性;胃癌组织中胞核表达与肿瘤浸润深度(P=0.000)、有无淋巴结转移(P=0.010)、TNM分期(P=0.000)有明显相关,浸润深度越深、出现淋巴结转移和TNM分期越晚,则胞核表达越弱,胞核表达还显示出与性别有一定相关性,男性表达水平较女性高(P=0.048),胞质表达水平则与性别无明确相关性,只显示与淋巴结转移(P=0.017)和TNM分期(P=0.019)有关,有淋巴结转移和TNM分期较晚的患者胞质表达水平较弱。结论:随着胃癌的进展,肿瘤分期越晚、浸润深度越深和出现淋巴结转移,则胃癌组织中胞质和胞核的APE表达水平越低。

大鼠癫痫持续状态后肌醇酶1α介导的内质网应激相关凋亡分子在海马中的表达

目的探讨肌醇酶10／．（inositol requiring enzyme1d，IRE1a）介导的内质网应激相关凋亡分子在大鼠癫痫持续状态（SE）后海马神经元损伤中的作用。方法Wistar大鼠按随机数字表随机分为对照组、SE组，SE组根据不同时间点又分为3、6、12、24、48h组。免疫荧光法观察葡萄糖调节蛋白78（glucose—regulating protein 78kd，GRP78）及磷酸化-IRE1a（p-IRE1a）在各组大鼠海马CA3区中的表达；蛋白质印迹检测磷酸化c-JunN端激酶（p-JNK）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（caspasel2）的表达变化；荧光TUNEL观察各组大鼠海马CA3区神经元凋亡变化。结果免疫荧光结果显示，对照组仅见少量GRP78、p-IRE1a阳性神经元（分别为6．90％-t-O．96％，4．60％±1．12％），SE各亚组GRP78、p-IRE1a阳性神经元均增多，SE后12h达高峰（GRP78：87．45％±3．63％，F=356．82，P〈0．05；p-IREl仅：86．90％±3．82％，F=300．80，P〈0．05）；蛋白质印迹结果显示，与对照组相比，p-JNK、caspasel2在SE各亚组表达均增多，SE后12h达高峰；同时TUNEL染色在SE各亚组均能检测到海马神经元凋亡，以SE后12h凋亡最严重，与p-IREld、p-JNK、caspasel2表达变化一致。结论大鼠SE后诱发了内质网应激，表现为内质网应激标志分子GRP78表达增加；IREl仅可能通过磷酸化JNK和活化easpasel2参与了SE后神经元凋亡损伤。

配合物[Co_2(EGTB)Cl_2]·(BF_4)_2·5H_2O与DNA相互作用的研究

用紫外光谱法、荧光光谱法、黏度法、凝胶电泳法研究了双核钴(Ⅱ)配合物[Co2(EGTB)Cl2]·(BF4)2·5H2O和DNA的相互作用,在pH=7.2的缓冲体系中,求得配合物与DNA的结合常数.结果表明,配合物在接近生理条件下能有效地断裂pBR322DNA,同时可使DNA的粘度增加,使EB-DNA体系的荧光强度降低.配合物与DNA的荧光光谱和紫外光谱表明,配合物与DNA的作用既存在部分插入结合又存在静电结合模式.

介绍一种简便、快速的回收DNA片段的方法

我们采用国产 DF-17型电洗脱槽回收了限制性内切酶酶切的 DNA 片段,证明该方法是一种简便、快速、可靠的回收核酸片段的方法.回收的 DNA 片段可进一步用于 DNA 克隆、探针标记和 DNA 分析.

利用CRISPR/Cas方法建立RNaseL基因稳定敲除细胞株

目的利用CRISPR/Cas9技术建立人RNase L基因稳定敲除的细胞株。方法根据Gen Bank中RNase L基因序列,设计RNase L敲除的小指导RNA(sgRNA)序列,将其克隆到p Cas-Guide真核表达载体中,获得p Cas指导RNA(gRNA)载体;设计供体DNA的同源臂序列,通过搭桥PCR将左同源臂、潮霉素B抗性基因和右同源臂扩增成为一条片段作为同源重组的修复模板,并将其克隆到p Back Zero-T表达载体上,获得p Back Zero-T-RNase LK载体。将上述两个载体共转染HEK293细胞,用潮霉素B筛选,通过Western印迹和DNA测序等技术验证RNase L从基因组上敲除。结果与结论成功构建了载体p Cas-gRNA和p Back Zero-T-RNase LK,Western印迹和DNA测序结果表明,成功获得5株RNase L缺失的细胞株,为探讨RNase L的生物学功能和研究其分子机制奠定了基础。