脱氧核糖核酸酶1在肾细胞癌中的作用及机制研究

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)患者在手术后对放疗、化疗和靶向治疗均不敏感。前期研究证明,在肝癌中,脱氧核糖核酸酶1(deoxyribonuclease 1-like 3,DNASE1L3)可以分解包膜内的单链和双链DNA,通过弱化糖酵解的限速酶,抑制细胞周期、增殖和代谢。然而,DNASE1L3在肾癌中的作用和相关机制尚不清楚。从癌症基因组图谱数据库(the Cancer Genome Atlas,TCGA)中下载并分析了肾癌RNA测序数据;使用(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库、人类蛋白质图谱数据库和免疫印迹验证DNASE1L3的表达水平;运用免疫相关数据库分析、划痕和侵袭实验,探究了DNASE1L3的作用和潜在机制。结果发现,在TCGA肾癌数据中,DNASE1L3表达量与患者的临床特征显著相关,且与患者生存期呈正相关;过表达DNASE1L3会抑制ACHN和786-O细胞的增殖和侵袭能力。结果表明,DNASE1L3可能成为肾癌患者诊断和治疗的潜在生物标志物。

活性位点附近氨基酸对解淀粉芽孢杆菌核糖核酸酶Barnase酶学性质的影响

Barnase活性位点附近氨基酸与底物之间的相互作用会影响酶与底物的识别从而影响酶的催化,为了研究活性位点附近氨基酸如何影响催化从而获得更高活性和稳定性的Barnase,采用定点突变技术对解淀粉芽孢杆菌BH072核糖核酸酶Barnase活性位点附近氨基酸进行突变,将突变体酶分别诱导表达、纯化并表征,检测其比酶活和热稳定性.得到最高比酶活的突变酶为N131A,比酶活为41.65 kU·mg^(-1),相较野生型提高了43.82%.该突变体在60℃放置12 h后仍能保持80%的酶活力.为了探究活性位点附近残基突变对催化反应造成影响的原因,笔者使用同源建模及分子对接分析了催化口袋与底物的相互作用,发现N131A突变提高了酶分子结合底物的能力.该研究所获得的突变体N131A进一步丰富了核糖核酸酶突变体酶库,具有良好应用前景.

猪链球菌2型核糖核酸酶Ⅲ的克隆表达及催化特性分析

为了研究猪链球菌2型(SS2)核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)的催化特性,利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达猪链球菌2型RNaseⅢ(SS-RNaseⅢ)并通过镍柱亲和层析的方法分离纯化。异源表达研究显示,重组蛋白RNaseⅢ大部分为可溶性表达;催化特性研究显示,RNaseⅢ主要依赖Mg^(2+)或Mn^(2+)发挥催化功能,并在不同离子浓度和pH值环境下具有不同的催化活性;底物特异性研究显示,RNaseⅢ特异性切割长度为30 bp的双链RNA,同时对内源性的rnc mRNA和5S rRNA具有良好的特异性。上述结果表明,相较于其他细菌RNaseⅢ,SS-RNaseⅢ具有独特的催化特性,为深入理解RNaseⅢ如何介导SS2致病机制奠定了基础。

表达核糖核酸酶基因的雄性不育油菜的获得

从细菌Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ染色体ＤＮＡ中克隆了ＲＮａｓｅ（ｂａｒｎａｓｅ）基因，构建了ＴＡ－２９基因５＇调控区（－１３００－＋３）与ｂａｒｎａｓｅ基因的嵌合基因，通过农杆菌介导的遗传转化，获得了“双低”甘蓝型油菜“中双８２１”的转基因植株。转化植株与末转化植株在高度、生长速度、花器形态、花色等方面基本相同，但转化植株花丝短小、花药干瘪、没有花粉；自花授粉或以其为父本进行的异花授粉均不能结实，表现为完全的雄性不育。

梨内源与外源核糖核酸酶对花粉萌发及花粉管生长的影响

将从沙梨(Pyrus pyrifolia)花柱中分离出的 RNase(内源 RNase)和外源RNase 添加于花粉萌发培养基培养二十世纪梨花粉。结果表明,低活性量(0.006 U)的RNase 对花粉萌发及花粉管生长的抑制作用弱;较高活性量(0.010 U)的RNase T 对花粉萌发及花粉管生长的抑制作用最强,其次为二十世纪花柱S-RNase 和RNase 1A;新水花柱S-RNase对花粉管生长抑制作用最弱;在添加这4种RNase的培养基中,二十世纪花粉管生长的长度分别是对照花粉管长度(410 μm)的 37%、40%、77% 和 79%。不含 S-RNase 的花柱RNase 虽然活性较高,但对自花花粉的萌发及花粉管生长没有抑制作用。

转染人核糖核酸酶抑制因子基因对B16黑色瘤细胞及肿瘤转移的影响(英文)

人核糖核酸酶抑制因子 (humanribonucleaseinhibitor ,RI)是一种细胞质中分子质量为 5 0ku的酸性糖蛋白 .RI能抑制核糖核酸酶A (RNaseA)的活性 ,RNaseA与血管生成因子 (angiogenin ,Ang)的氨基酸有着高度保守的同源序列 .Ang是RNaseA超家族的一员 ,RI通过与RNaseA和Ang的紧密结合而抑制其活性 .血管生成及新血管的形成 ,是肿瘤发生和转移的必要条件 .所以抗血管生成将是一种很有希望的对抑制肿瘤生长和转移的有效方法 .实验显示RI能有效地抑制肿瘤诱导血管的生成 .RI由含有许多亮氨酸重复序列的多肽组成 .含有这样重复序列的 10 0多种蛋白质显示了广泛的功能 ,包括细胞周期调节 ,DNA修复 ,对细胞外基质相互作用以及抑制酶活性等 .RI被认为是胚胎发育 ,创伤愈合及肿瘤发生中新血管形成的一种调节因子 .RI定位于染色体的 11p15 5 ,与ras基因邻近 ,在肿瘤病人中经常存在染色体 11p15 5部位的变异和异常 .RI可能与细胞的生长和分化有关 ,因此 ,RI可能还具有尚未知的生物学作用 .为了进一步了解RI的潜在功能以及探讨RI与肿瘤侵润、转移的关系 ,将人的核糖核酸酶抑制因子基因的cDNA通过逆转录包装细胞PA317,并转染到B16小鼠黑色瘤细胞中 ,用转染空载体和未转染的B16细胞作为对照 .通过PCR ,RT PCR 。

抗核糖核酸酶抑制因子抗体的制备与纯化

目的 :制备并纯化抗核糖核酸酶抑制因子 (RI)的抗体。方法 :从人胎盘中提取RI,经亲和层析纯化后免疫家兔制备RI抗体。用rProteinASepharoseFastFlow层析对抗RI抗体进行纯化 ,并用SDS PAGE、ELISA及Westernblot等进行鉴定。结果 :制备并纯化了抗RI抗体 ,经SDS PAGE分析达到了电泳纯。结论 :获得了效价高、特异性强、稳定性好的抗RI抗体 。

FTIR法研究核糖核酸酶（RNase A）二级结构随温度的变化

本文利用ＦＴＩＲ法研究了牛胰核糖核酸酶（ＲＮａｓｅＡ）二级结构随温度的变化。结果表明，α－螺旋结构随温度的变化较大，β－折叠的结构变化是一个比较复杂的过程。

重金属离子对牛胰核糖核酸酶的作用机理

通过在核糖核酸酶介质中加入Ce3 +,Cd2 +,Pb2 +,研究其对核糖核酸酶活性影响的作用机理。结果表明低浓度重金属离子对酶活性有激活作用 ,高浓度则严重抑制酶活性。荧光滴定表明在一个RNase分子上结合一个Ce3 +、或三个Cd2 +、或三个Pb2 +,因而导致了酶的构象改变 。

TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白原核载体的构建及表达

目的:构建蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD)TAT和乙肝病毒靶向核糖核酸酶(targeted ribonuclease,TR)融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达。方法:将已构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV core protein,HBVc)基因、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(human eosinophil derived neurotoxin,hEDN)基因,克隆人含PTD TAT的pTAT原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功地构建了乙肝病毒靶向核糖核酸酶及其两个对照的融合蛋白原核表达载体,并在IPTG诱导下获得特异性表达。结论:Tat-乙肝病毒 靶向核糖核酸酶融合蛋白的构建,为体内应用靶向核酸酶治 疗乙型肝炎奠定了基础。

Pb^(2+)对核糖核酸酶活性及其结构的影响

通过各种光谱学手段研究了Pb2 +对核糖核酸酶活性的影响及其作用机制.结果表明低浓度的Pb2 +可提高酶活性,高浓度则严重抑制酶活性,这是因为在高浓度下Pb2 +能完全竞争出核糖核酸酶中的Ca2 +,荧光滴定显示核糖核酸酶可结合 3个Pb2 +.利用EXAFS表征出Pb2 +已结合到核糖核酸酶主链氨基酸残基上,与N或O发生了配位,Pb—N(或O)键长分别为 0.2 42nm和 0.312nm,配位数均为 2.圆二色谱测试进一步表明高浓度的Pb2 +结合使核糖核酸酶的二级结构遭到严重破坏,α 螺旋含量、β 折叠及 β 转角大量下降。

重组人核糖核酸酶抑制因子 基因的siRNA表达载体构建及B16细胞中基因沉默的鉴定

人核糖核酸酶抑制因子(Human ribonuclease inhibitor, hRI)是细胞质中的一种酸性糖蛋白,可以与血管生长因子(Angiogenin, Ang)紧密结合从而抑制血管形成.利用全基因组合成法合成针对人核糖核酸酶抑制因子基因(hri)的发夹shRNA序列,亚克隆到siRNA表达载体pKD;重组载体经酶切鉴定后,用脂质体法与报告基因绿色荧光蛋白重组融合的人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri共转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,在荧光显微镜下检测干扰效果.用Image-Pro plus 4.5软件对绿色荧光照片半定量分析干扰效率.结果表明,荧光显微镜显示B16中表达的绿色荧光被干扰,荧光强度半定量分析干扰效率可达80%以上.成功重组构建了针对hri的siRNA表达载体.

人乳腺癌组织中核糖核酸酶抑制因子基因的表达分析

背景与目的:核糖核酸酶抑制因子(ribonucleaseinhibitor,RI)是一种多功能的酸性糖蛋白,人胎盘中富含RI。我们的前期研究表明,从人胎盘中提纯的RI能明显抑制小鼠某些实体瘤(S180肉瘤、Ca761乳腺癌和H22肝癌)的生长。本研究的目的是观察人乳腺癌组织中RI基因的表达水平。方法:采用RT-PCR及毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)法检测人乳腺癌组织中RImRNA的表达水平,采用Westernblot方法检测人乳腺癌组织中RI的含量。结果:与对照乳腺组织相比,乳腺癌组织RT-PCR产物的电泳条带较窄;乳腺癌组织Westernblot的斑点较小。乳腺癌组织RT-PCR产物毛细管电泳吸收曲线峰高及峰宽明显小于对照乳腺组织;乳腺癌组织和对照乳腺组织RT-PCR产物毛细管电泳吸收峰面积积分值分别是(3.320±0.365)×106和(4.385±0.880)×106,两组间比较有显著性差异(P<0.01)。结论:与正常乳腺组织相比,人乳腺癌组织中RImRNA表达水平明显降低,RI蛋白含量也明显减少,表明人乳腺癌组织中RI基因表达明显下调。

聚乙二醇修饰牛胰核糖核酸酶

采用N 羟基珀酰亚胺活化酯法活化单甲氧基聚乙二醇 ,测定了聚乙二醇 (PEG)的活化度为86 2 %。以活化的PEG对牛胰核糖核酸酶进行化学修饰 ;分析了蛋白质被修饰程度。用毛细管电泳法给出了被修饰蛋白的修饰度与修饰蛋白分布的定量结果。比较了被修饰产物对大分子底物 (酵母RNA)与小分子底物 (2’ ,3’ 环磷酸胞嘧啶 )的降解活力 ,其表观酶活力分别保留了 5 2 8%和 66 3 %。

干旱胁迫对小麦叶片核糖核酸酶活力及合成的影响

干旱协迫下，抗旱（陕合６号）与干旱敏感（郑引１号）小麦品种叶片中的核糖核酸酶活性均有所增加，增加幅度与其相对含水量变化呈显著负相关。１４Ｃ－Ｌｅｕ掺入后，样品粗提液经ＰＡＧＥ分离并染色，发现干旱处理叶片的两个低分子女（１２ｋＤ、１７ｋＤ）具ＲＮａｓｅ活性的蛋白质的放射性掺入总量低于对照，但占总蛋白的放射性比例高子对照，证明干旱胁迫下存在ＲＮａｓｅ的从头合成（ｄｅｎｏｖｏｓｙｎｔｈｓｉｓ）。讨论了胁迫下ＲＮａｓｅ活性增加的原因。

核糖核酸酶抑制因子基因在人乳腺癌中的表达及突变分析

目的 通过核糖核酸酶抑制因子 (ribonucleaseinhibitor,RI)基因在人乳腺癌中的表达及其是否突变的分析 ,进一步探讨RI与肿瘤细胞生长的关系。方法 采用Westernblotting方法检测人乳腺癌组织中RI的表达量 ;采用SSCP的方法分析肿瘤细胞RI基因中是否有突变。结果 人乳腺癌组织中RI的表达明显低于同体癌旁正常组织 ,但用MboI酶切及SSCP分析未发现人乳腺癌组织中RI基因有突变。结论 乳腺癌的生长可能与RI表达的下降有关 ,从而可能使癌组织周边新血管的形成未受到有效抑制的结果。

外源精胺对水分胁迫下小麦幼苗蛋白酶和核糖核酸酶活性的影响

通过营养液培养实试,研究了水分胁迫下外源精胺(Spm)对抗旱性不同的小麦品种蛋白酶及RNase活性的影响。研究表明,水分胁迫下,小麦叶片的蛋白酶、RNase活性上升,可溶性蛋白和非水溶性蛋白RNA含量下降;抗旱性强的品种酶活性上升的幅度小于干旱敏感的品种,而蛋白质与核酸含量下降的幅度也小于干旱敏感的品种;外源精胺处理,减缓酶活性上升,蛋白质和核酸含量下降的幅度变小,且外源Spm对干旱敏感的品种缓解水分胁迫的作用大于抗旱性强的品种。

花粉特异性核糖核酸酶基因诱导籼稻雄性不育及其遗传研究

以水稻愈伤组织和悬浮细胞系作为基因枪转化的外植体,把水稻花粉特异性基因PS1启动子与barnase构成的嵌合基因导入籼稻,获得籼稻五个品种Basmati 1、青油占、胜优2号,明恢63,新山占29的转基因植株.试验以两个质粒PS1- barnase和pILTAB227共转化的方法,以潮霉素B作为筛选因子,选择抗性愈伤及再生植株.获得的barnase转基因植株的育性比未转化的对照明显降低,表现为部分不育和完全不育.除barnase阳性转化株平均株高比对照有所降低外,营养器官发育正常,雌性可育.完全不育的植株花粉粒畸形,不能被I-KI溶液染色,但它们与正常植株杂交能够获得杂交种子.转基因植株的Sonthern杂交分析表明,bamase基因普遍为多拷贝整合.对转基因植株白交及与非转化株测交后代以点杂交分析bamase转基因的遗传行为,发现转基因的遗传符合1～3个插入位点的孟德尔遗传模式.

巨大芽孢杆菌产胞外核糖核酸酶的分离纯化及部分酶学性质研究

巨大芽孢杆菌发酵液经硫酸铵沉淀、CM-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,纯化得到核糖核酸酶电泳纯品,并对其性质进行研究。该酶比活力为54272.27U/mg,回收率为11.37%,纯化倍数为606.67倍。该酶分子质量约为33.3kD,最适温度为52.5℃,最适pH值为8.5,在20～40℃以及pH6.0～7.0范围内稳定性较好。Fe2+、Cu2+、SDS、抗坏血酸和草酸对该酶活性有抑制作用。