核糖核酸酶A专栏导读

长久以来,我们“顾名思义”,“理所当然”地认为核糖核酸酶A的功能就是降解核糖核酸(RNA)。事实上,随着研究的深入,发现该家族不少成员不仅能降解RNA,而且能精准地在特定位点切割RNA产生功能性非编码RNA,甚至具有“非酶”功能!例如,我们课题组研究的核糖核酸酶A超家族成员5(ribonuclease 5,也称angiogenin,中文译为“血管生成素”)不仅以酶的形式参与RNA代谢(主要是rRNA、tRNA和miRNA)。

核糖核酸酶A超家族:不仅仅是一组降解RNA的酶

核糖核酸酶A超家族(ribonuclease A superfamily;RNase A superfamily),也称脊椎动物分泌型核糖核酸酶超家族(vertebrate secreted ribonucleases superfamily),是二十世纪蛋白质结构、酶学和分子进化领域研究最多最广泛的核糖核酸酶家族。自上世纪初期从牛胰腺中分离鉴定第一个成员以来,已从哺乳动物、两栖动物、爬行动物、鸟和鱼等几百种动物中鉴定了几千个成员。早期对该家族成员的研究不仅促进了蛋白质化学技术的发展,而且为现代生物学研究奠定了基础。目前已知人的核糖核酸酶A超家族成员包括8个典型成员(RNase 1~RNase 8)和5个非典型成员(RNase 9~RNase 13)。功能方面,曾一度以为该家族成员只具有降解核糖核酸的能力。随着血管生成素(angiogenin;RNase 5)、嗜酸性粒细胞衍生神经毒素(eosinophils-derived neurotoxin, EDN;RNase 2)、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophils cationic protein, ECP;RNase 3)的发现,人们意识到该家族成员除了消化核糖核酸外,还有依赖酶活性和不依赖酶活性的其他功能,包括宿主防御、免疫调节、血管生成和肿瘤抑制等,但仍了解不够全面。本文回顾了核糖核酸酶A超家族的研究历程,探讨了未来研究方向,特别呼吁要系统研究其除降解核糖核酸外的其他生理病理功能,希望能为该领域的研究提供思路。

核糖核酸酶A家族典型成员在肿瘤发生中的作用

人体中核糖核酸酶A(ribonuclease A,RNaseA)家族包含8个典型成员(RNase 1至RNase 8)。已有研究显示,除RNase 8外,该家族其它典型成员影响了胰腺癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌和皮肤癌等多种肿瘤的发生发展。在肿瘤发生过程中,特定RNase表达量及糖基化修饰会发生显著改变,是肿瘤诊断的潜在标志物;它们能以多种机制参与肿瘤发生、生长和转移等过程,有望成为肿瘤治疗的靶点;而部分成员则具有杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤发展的功能,存在临床开发成肿瘤治疗药物的可能。具体而言,RNase 1通过核糖核酸酶活性依赖的细胞毒性和细胞外RNA降解功能,发挥直接杀伤肿瘤细胞或降低局部炎症而抑制肿瘤生长的作用;RNase 1还能结合并激活促红细胞生成素,产生肝细胞癌受体相互作用蛋白A4 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor-interacting protein A4, EphA4)信号通路,促进乳腺癌的发生。RNase 2和RNase 3是嗜酸性粒细胞颗粒蛋白质的重要成分,依赖于阳离子性及核糖核酸酶活性在抗肿瘤免疫防御中发挥重要作用。RNase 4和RNase 5则通过诱导血管生成、加快肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡等方式,促进肿瘤发生发展。其中RNase 5发挥作用的分子机制包括促进47 S前体rRNA转录和激活促肿瘤生长的信号通路,以及产生tRNA衍生的应激诱导的RNA(tRNA-derived stress-induced RNA,tiRNA)等。虽然RNase 6和RNase 7与肿瘤的发生存在相关性,但其具体作用及机制的研究仍较少。本文总结了RNase A家族典型成员与肿瘤的相关性和作用机制,并对其临床应用前景进行了展望,以期为肿瘤治疗药物的开发提供新思路。

人核糖核酸酶A超家族抗微生物活性及其作用机制

人核糖核酸酶A(human RNase A)超家族包含13个具有不同生物活性的成员(RNase 1~RNase 13),其蛋白质结构除具有催化保守序列外,还具有显著多样性的序列,决定了人类核糖核酸酶A可发挥核糖核酸酶活性之外的生物学功能。人核糖核酸酶A超家族成员在多种免疫细胞例如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中表达,并可被分泌以发挥多种多样的生物学功能,包括抗微生物活性、促进宿主防御、参与血管生成及精子成熟等。其中,人核糖核酸酶A超家族部分成员,可通过水解病毒RNA、抑制病毒复制、破坏细菌细胞壁、促进微生物凝集、损伤寄生虫细胞膜和线粒体膜等直接作用,以及通过宿主天然免疫细胞介导的间接作用,发挥抗微生物及寄生虫活性,参与宿主防御。本文对人核糖核酸酶A的抗微生物(包括病毒、细菌、真菌)和抗寄生虫活性及其作用机制进行综述,并对人核糖核酸酶A作为抗微生物活性物质和天然免疫分子,用于治疗严重和耐药微生物感染的前景进行展望。

核糖核酸酶A超家族抗菌活性评价

抗菌肽是机体重要的免疫防御分子,具有广谱杀菌活性。核糖核酸酶A是脊椎动物特异性的分泌型蛋白质,在人基因组中包含8个经典成员(RNase1-8)。它们作为一类重要的抗菌肽,广泛分布于机体需要抵抗外界病原微生物的组织中,除了特有的生物学功能外,均具有一定的抗菌活性。然而,目前各实验室对它们抗菌活性的报道并不一致,有必要开展横向比较分析。为此,我们表达纯化了人核糖核酸酶A超家族8个成员的重组蛋白质,并在同一实验条件下以半致死浓度评估了它们对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的抗菌活性。结果显示,RNase1-8重组蛋白质对大肠杆菌半数致死浓度分别为:0.081,0.046,0.008,0.250,2.028,0.072,0.001μmol·L~(-1)和1.1416μmol·L~(-1);对金黄色葡萄球菌半数致死浓度分别为:3.427,1.856,2.211,5.188,8.274,4.356,2.502μmol·L~(-1)和9.916μmol·L~(-1)。该结果提示,RNase1-8对大肠杆菌的抗菌活性存在明显差异,其中RNase3和RNase7活性最强,且均显著高于各自对金黄色葡萄球菌的抗菌活性;8个成员对金黄色葡萄球菌的抗菌活性无明显差异。据此我们认为,核糖核酸酶A超家族对革兰氏阴性菌具有较好的杀伤活性,可用于革兰氏阴性菌抗菌产品的开发。

核糖核酸酶A超家族成员杀菌作用研究进展

核糖核酸酶A超家族是一类以牛胰腺核糖核酸酶A为代表的、从不同脊椎动物中分离到的同源蛋白组成,其中几个成员具有选择性抗微生物活性,不同成员杀菌作用的机制不同。本文对近年发现的核糖核酸酶A超家族成员的杀菌谱及其作用机制的研究成果进行了总结,并分析了当前存在的问题和解决的思路。核糖核酸酶独特的杀菌作用机制在新药开发中具有引人瞩目的前景,基于其独特的分子骨架设计合成新一类抗生素,可能在微生物感染的临床治疗中发挥作用。

核糖核酸酶A在端粒免疫荧光原位杂交实验中的应用

目的:在端粒免疫荧光原位杂交实验中,降低核仁着色对端粒图像清晰度的影响。方法:分别将0.1、0.2、0.4 mg/m L的核糖核酸酶(RNase)A与待检标本于37℃消化过夜,然后进行端粒原位杂交实验。结果:0.4 mg/m L RNase A可以消除Hep G2细胞端粒原位杂交时的非特异结合,使用He La、293T和U2OS细胞也有同样效果。结论:在进行端粒原位杂交实验时,用0.4 mg/m L RNase A消化核仁可减少探针的非特异结合,提高端粒图像的清晰度。

核糖核酸酶A超家族及其生物学活性

核糖核酸酶A超家族也即牛胰腺核糖核酸酶家族,它包含了与牛胰腺核糖核酸酶同源的所有脊椎动物核糖核酸酶.核糖核酸酶A超家族的大部分成员具有特殊的生物学活性,有的还具有细胞毒性,能够抑制肿瘤细胞的生长,有望成为抗肿瘤的新药.本文对核糖核酸酶A超家族成员极其生物学活性做了介绍.

核糖核酸酶A家族成员2基因与胶质瘤免疫浸润水平及临床预后的关系分析

目的通过生物信息学分析核糖核酸酶A家族成员2(RNASE2)基因与胶质瘤免疫浸润水平及临床预后的关系。方法通过生物信息分析获取癌症基因组图谱(TCGA)及中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据库中RNASE2基因在胶质瘤中的表达情况,并分析RNASE2基因与胶质瘤预后、免疫浸润的关系及相应的信号通路。结果RNASE2基因在胶质瘤中的表达水平高于癌旁组织(P﹤0.05)。RNASE2基因表达水平在世界卫生组织(WHO)Ⅱ级、WHOⅢ级、WHOⅣ级胶质瘤中依次递增,且在复发胶质瘤中的表达水平明显高于原位胶质瘤,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。RNASE2低表达的胶质瘤患者生存情况明显优于RNASE2高表达患者,差异有统计学意义(P﹤0.01)。RNASE2 mRNA表达水平与CD8+T细胞呈负相关,与调节性T细胞呈正相关(P﹤0.05)。富集分析显示,RNASE2与免疫、炎症调控的信号通路相关。结论RNASE2基因在胶质瘤中表达上调,影响胶质瘤免疫浸润水平,导致免疫微环境失衡,进而造成不良预后。表明RNASE2的转录水平可作为预测胶质瘤预后和免疫浸润的生物标志物。

体外重折叠核糖核酸酶A及其荧光结构表征

核糖核酸酶A(RNase A)作为蛋白质体外重折叠研究的模型蛋白,考察了稀释复性过程中脲浓度、稀释倍数、氧化还原环境(GSH浓度和GSH/GSSG比例)、pH值、温度以及聚集抑制剂的添加对该酶活性回收率的影响.在变性蛋白浓度为100μg?mL-1,复性液含有2 mol?L-1脲,GSH浓度2 mmol?L-1,GSH/GSSG比为4∶1,pH8.0,并添加终浓0.1%的PEG,转速为150 r?min-1,温度37℃的条件下复性,RNase A的活力回收率可达70%以上.利用荧光分析法对RNase A复性过程的结构变化进行了表征,在此基础上对RNase A体外重折叠过程蛋白质分子的构象变化以及活性中心的形成过程进行了阐述.

SDS溶液中核糖核酸酶A的结构及活性研究

用紫外可见分光光度法研究了室温条件下,RNase A在SDS溶液中紫外特征吸收峰的变化和这一变化过程的ΔG,分析了SDS对RNase A结构的影响,同时研究了在SDS溶液中RNase A催化2′,3′-环腺甘酸单磷酸水解反应,得到了不同SDS浓度的kcat和Km,分析了SDS对RNase A活性的影响.结果表明,随着SDS的浓度的增加,RNase A的结构逐渐瓦解,直至完全失活.这主要是SDS与RNase A之间的静电和疏水相互作用的协同效应的结果.

核糖核酸酶A在丁酸十二铵-环己烷反胶束溶液中的催化动力学

研究了核糖核酸酶Ａ（ＲＮａｓｅＡ）在丁酸十二铵（ＤＡＢ）－环己烷反胶束溶液中催化水解胞苷２，３－环单磷酸酯的动力学，数据符合Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ酶催化机理．以ｋｃａｔ／Ｋｍ表示酶催化活性时，ＲＮａｓｅＡ在反胶束溶液中的催化活性是在水溶液中的１４～３０倍．无论是固定ＤＡＢ浓度还是固定Ｈ２Ｏ与ＤＡＢ浓度之比，随增溶水量的增加，ｋｃａｔ／Ｋｍ呈下降趋势．

核糖核酸酶A在DAB-环己烷溶液中的活性和构象

The activity and conformation of ribonuclerse A (RNaseA) solubilized in cyclohexane via dodecylammonium butyrate(DAB) reverse Ancelles were investigated. The activity of RNaseA was studied using the cytidine 2’,3’-phosphate as the substrate, and it was found that kcat increases significantly with respect to that in water attended by an increased Km·FT-IR spectra of RNaseA in reverse Ancellax solution were investigated as a function of w0(= [H2O]/ [DAB]), and it was noted that the structure of RNaseA became looser in reverse micelles campared to that in aqueous solution. The relation between activity and conformation was discussed.

松鼠胰腺型核糖核酸酶A基因的克隆与表达

核糖核酸酶A(ribonucleases A,RNases A)构成一个大家族,其成员表现出不同程度的水解RNA的酶活性。一些成员还表现出特殊的生物学活性。旨在克隆松鼠核糖核酸酶A的基因,利用原核细胞系统表达重组蛋白,并进行初步的酶学性质的研究。结果表明,所克隆的基因属于核糖核酸酶A家族,保留了核糖核酸酶A家族酶活性必要的保守序列。进化分析表明,该基因属于松鼠胰腺型核糖核酸酶基因,与其它啮齿类动物胰腺型酶一样,重组的核糖核酸酶具有酶活性,为进一步进行啮齿类动物核糖核酸酶的宿主防卫功能研究打下了基础。

具有合成核酸活性的多肽 Ⅰ.C-端去四肽和去六肽核糖核酸酶A及其水解和合成活性

核糖核酸酶A(RNase A)的结构与功能的关系虽属已知[1-9],但大都限于水解作用方面,而关于合成作用方面的报道则颇少[10,11].根据前人用抑制剂法所得羧甲基化核糖核酸酶A的衍生物(CM-RNase A).

猪链球菌2型核糖核酸酶Ⅲ的克隆表达及催化特性分析

为了研究猪链球菌2型(SS2)核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)的催化特性,利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达猪链球菌2型RNaseⅢ(SS-RNaseⅢ)并通过镍柱亲和层析的方法分离纯化。异源表达研究显示,重组蛋白RNaseⅢ大部分为可溶性表达;催化特性研究显示,RNaseⅢ主要依赖Mg^(2+)或Mn^(2+)发挥催化功能,并在不同离子浓度和pH值环境下具有不同的催化活性;底物特异性研究显示,RNaseⅢ特异性切割长度为30 bp的双链RNA,同时对内源性的rnc mRNA和5S rRNA具有良好的特异性。上述结果表明,相较于其他细菌RNaseⅢ,SS-RNaseⅢ具有独特的催化特性,为深入理解RNaseⅢ如何介导SS2致病机制奠定了基础。

旋毛虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ蛋白的制备及其定位研究

为获得旋毛虫(T1)脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNase Ⅱ)蛋白,观察其在肌幼虫虫体中的分布,以旋毛虫(T1)肌幼虫cDNA为模板,利用RT-PCR技术扩增旋毛虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ(TsDNase Ⅱ)蛋白的编码基因tsdnase Ⅱ,将其克隆到原核表达载体pCold-TF中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,以IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)及Western blot分析重组Ts DNaseⅡ(rTsDNase Ⅱ)蛋白的反应原性;将rTsDNase Ⅱ蛋白免疫6-8周BALB/c小鼠,制备其多克隆抗体;制作旋毛虫肌幼虫冰冻切片,利用免疫荧光试验观察TsDNase Ⅱ蛋白在虫体中的分布。结果,成功地扩增出了长度为942 bp的旋毛虫tsdnase Ⅱ基因片段,构建了其原核表达质粒pCold-TF-tsdnase Ⅱ;转化了重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)成功可溶表达了rTsDNase Ⅱ,大小为86 kDa;ELISA与Western blot分析结果显示,rTsDNase Ⅱ蛋白能与感染旋毛虫的小鼠血清发生特异性反应;冰冻切片免疫荧光分析显示,TsDNase Ⅱ分布于旋毛虫肌幼虫整个虫体。研究结果为进一步分析TsDNase Ⅱ的特性与功能、利用该蛋白研发旋毛虫病新型防控策略打下了基础。

调节性核糖核酸酶1对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的探讨调节性核糖核酸酶1(Reg1)对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的保护作用及机制。方法2018年8月至2020年2月构建高糖诱导的RGC-5视网膜神经节细胞损伤模型,实验分为四组:Con组(正常糖+未转染的RGC-5细胞)、HG组(高糖+未转染的RGC-5细胞)、pcDNA3-Reg1组(高糖+转染Reg1过表达质粒的RGC-5细胞)、pcDNA3-NC组(高糖+转染对照质粒的RGC-5细胞)。实时荧光定量聚合酶链式反应检测Reg1、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达;蛋白质免疫印迹检测Reg1、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)、磷酸化p65(p-p65)、磷酸化核因子κB抑制蛋白α(p-IκBα)的表达;免疫荧光染色检测Reg1、p-p65的表达;TUNEL染色检测凋亡水平;酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中各炎性因子的含量。结果Con组中Reg1的相对荧光强度、mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为1.00±0.21、1.00±0.15、1.00±0.18,HG组Reg1的相对荧光强度、mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为2.49±0.36、3.86±0.42、3.17±0.39,pcDNA3-Reg1组Reg1的相对荧光强度、mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为6.77±0.72、8.18±0.67、6.30±0.51,pcDNA3-NC组Reg1的相对荧光强度、mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为2.75±0.40、3.59±0.38、2.85±0.34,HG组、pcDNA3-NC组Reg1相对荧光强度、mRNA和蛋白质相对表达量高于Con组,且低于pcDNA3-Reg1组(P<0.05)。Con组TUNEL+细胞比例、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为(1.73±0.22)%、1.00±0.28、1.00±0.20、1.00±0.17,HG组TUNEL+细胞比例、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为(14.79±0.83)%、0.29±0.11、5.25±0.66、4.93±0.52,pcDNA3-Reg1组TUNEL+细胞比例、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为(3.77±0.34)%、0.58±0.43、2.51±0.45、2.58±0.33,pcDNA3-NC组TUNEL+细胞比例、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为(14.55±0.90)%、0.21±0.14、5.14±0.59、4.77±0.46,Con组、pcDNA3-Reg1组TUNEL+细胞比例、Bax、cleaved caspase-3蛋白质相对表达量低于HG组、pcDNA3-NC组,而Bcl-2蛋白质相对表达量高于HG组、pcDNA3-NC组(P<0.05)。Con组、pcDNA3-Reg1组细胞IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-αmRNA相对表达量,及上清液蛋白质含量低于HG组、pcDNA3-NC组(P<0.05)。Con组、pcDNA3-Reg1组p-p65相对荧光强度,及p-p65、p-IκBα蛋白质相对表达量低于HG组、pcDNA3-NC组(P<0.05)。结论高糖状态下RGC-5视网膜神经节细胞高表达Reg1,上调Reg1表达可以降低细胞凋亡及炎症,可能与抑制NFκB信号通路活化有关。

胰核糖核酸酶A的原核表达及纯化复性研究

生化提取牛胰核糖核酸酶A工艺复杂、得率较低,而且动物源产品不能用于基因免疫质粒的生产。该工作采用原核表达路线解决上述问题。提取牛胰腺总RNA,利用RT-PCR扩增获得牛核糖核酸酶A基因,连入pGEM-T中测序验证。目的基因克隆到表达载体pET32a中,摇瓶培养得到带有Trx标签的融合蛋白表达产物,为包涵体表达形式。裂解上清经8mol/L尿素变性后采用镍柱纯化,在柱上用肠激酶切掉标签得到纯化的目的蛋白。目的蛋白经稀释复性后检测酶活。SDS-PAGE检测得到目的蛋白为Mr16k。经检测,复性纯化的核糖核酸酶A具有良好的RNA降解活性。