新型抗HIV药物靶点核糖核酸酶H抑制剂的研究进展

随着艾滋病感染人数和HIV耐药性突变的不断增加,对抗HIV新药需求越来越强烈。目前抗HIV新药研究主要分两方面进行,一方面是针对现有靶点开发新药,另一方面致力于寻找新的药物靶点。核糖核酸酶H是逆转录酶上具有自身独特酶功能的催化区域,成为抗HIV药物研究的一个新靶点。本文主要对近年来发现的核糖核酸酶H抑制剂进行总结,阐述其作用机制,为进一步深入开展核糖核酸酶H抑制剂的改造和设计提供一些信息。

乙型肝炎病毒核糖核酸酶H基因表达及鉴定

目的 乙型肝炎病毒核糖核酸酶 H (HBV- RNase H)为该病毒生活周期中负链 DNA合成所必需 ,获取该基因片段及其表达蛋白 ,为进一步的基础研究及应用研究创造条件 .方法 以 HBV全基因片段为模板 ,PCR方法定位扩增 HBV-RNase H特异性片段 ,连接于 p T7Blue克隆载体 ,酶切鉴定并测序后克隆于 p GSTag载体进行原核表达 .PAGE电泳及Western杂交鉴定表达产物 .结果 DNA测序结果显示 PCR扩增产物及载体中插入片段与已知序列相同 ;Western杂交结果表明 ,所表达产物为 GST与 RNase H的融合蛋白 .结论 HBV- RNase H基因的成功克隆及表达为进一步研究

重组人乙型肝炎病毒核糖核酸酶H基因工程菌发酵条件的初步研究

目的研究表达乙型肝炎病毒核糖核酸酶H1及H2 (HBV -RNaseH1及H2 )工程菌的发酵条件。方法采用摇瓶发酵,研究不同宿主菌表达HBV- RNaseH1及H2的效果,同时对培养基、诱导时期、诱导时间、初始pH值等发酵条件以及质粒稳定性进行研究。结果选用EcoliBL2 1为宿主菌,在LB培养基中培养至A60 0nm为0 .6时,诱导表达4 .5h ,HBV- RNaseH1及H2表达量最高达33.6 %和30 .8%。且重组质粒具有良好的分离稳定性和结构稳定性。结论此发酵条件可以较好地提高HBV- RNaseH1及H2的表达量。

重组人乙型肝炎病毒核糖核酸酶H基因工程菌的生物活性研究

目的:研究表达乙型肝炎病毒核糖核酸酶H(HBV RNaseH)工程菌的发酵条件。方法:采用摇瓶发酵,研究不同宿主菌对表达HBV RNaseH的效果;同时对培养基、诱导时期、诱导时间、初始 pH等发酵条件以及质粒稳定性进行研究。结果:选用E coliBL21为宿主菌,在LB培养基中培养至A600为0. 6时,诱导表达4. 5 h,HBV RNaseH表达量最高达33. 6%。而且重组质粒具有良好的分离稳定性和结构稳定性。结论:此发酵条件可以比较好的提高 HBV RNaseH的表达量,为发酵规模的扩大奠定了基础。

化学合成类HIV整合酶和核糖核酸酶H双靶点抑制剂的研究进展

尽管已有31种上市的单靶点抗HIV药物和高效抗逆转录病毒疗法用于AIDS的临床治疗,但寻找安全高效的新型抗HIV药物仍是全世界面临的一项严峻挑战。单组分多靶点药物具有降低耐药的可能性、简化给药剂量及提高患者服药顺从性等优点,现已成为抗HIV药物研发领域的热点。HIV整合酶(IN)和核糖核酸酶H (RNase H)均为病毒复制过程中的关键酶,是药物开发的重要靶标。近年来,通过合理药物设计和筛选途径,发现了多种结构类型的HIV IN和RNase H (IN/RNase H)双靶点抑制剂。本文主要对化学合成类HIV IN/RNase H双靶点抑制剂的研究进展进行介绍,以望对多靶点抗HIV药物的研发有所启示。

核酸适配体类抗HIV-1药物的研究进展

核酸适配体是指能特异结合蛋白质或其它小分子物质的寡核苷酸片段,可通过对某些酶或蛋白因子的抑制达到抗病毒的目的。近年来,核酸适配体类药物的研发已经取得了进展,尤其是在抗艾滋病病毒方面,此类药物展现出了广阔的临床应用前景。目前,核酸适配体类抗HIV-1药物按作用机制可分为抑制HIV-1逆转录酶的适配体、抑制HIV-1核糖核酸酶H的适配体和抑制HIV-1Tat蛋白介导的反式激活的适配体。介绍这3种核酸适配体类抗HIV-1药物的有关研究情况。

RNaseH依赖性PCR扩增结合熔解曲线法鉴别石菖蒲与藏菖蒲掺杂

目的采用核糖核酸酶H依赖性PCR(rhPCR)扩增结合熔解曲线分析对石菖蒲与藏菖蒲进行快速鉴定及相互掺杂检测。方法比对分析石菖蒲与藏菖蒲核基因组内转录间隔区2(ITS2)序列,寻找稳定的单核苷酸多态性(SNP)位点设计特异性扩增引物,根据扩增产物熔解温度(T m)不同进行鉴别,考察引物特异性,筛选最佳混合引物比例,并考察该方法灵敏度、掺混检出限及适用性。结果设计的特异性引物具有良好特异性,石菖蒲、藏菖蒲扩增产物可分别产生(89.4±0.2)与(87.9±0.2)℃的单一特异性熔解曲线峰。所建立的方法灵敏度高,DNA检出限均为0.1 ng,对石菖蒲和藏菖蒲的掺混检出限均为10%。检测样品28份,其中石菖蒲16份、藏菖蒲12份,检测结果与DNA条形码结果一致。结论该研究基于RNase H依赖性PCR扩增结合熔解曲线建立的石菖蒲及藏菖蒲鉴别及掺杂检测方法可有效鉴别石菖蒲、藏菖蒲及掺杂样品,有利于石菖蒲药材质量控制。

血浆长链非编码RNA核糖核酸酶PRNA成分H1表达与急性淋巴细胞白血病患儿免疫表型的相关性分析

目的探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿血浆长链非编码RNA(LncRNA)核糖核酸酶P RNA成分H1(RPPH1)表达水平,分析其与ALL患儿免疫表型的相关性。方法收集该院2017年12月—2019年12月89例ALL患儿为研究对象(观察组),同时期90例健康体检儿童作为对照(对照组)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血浆中LncRNA RPPH1水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中肿瘤坏死因子(TNF-α)水平;流式细胞术(FCM)检测骨髓中免疫表型。分析血浆中LncRNA RPPH1、免疫表型与TNF-α的关系及LncRNA RPPH1水平与免疫表型关系。结果与健康对照组相比[(1.00±0.25),(0.96±0.23)ng/ml],观察组血浆中LncRNA RPPH1(2.15±0.69)、TNF-α[(1.83±0.45)ng/ml]水平升高(P<0.05)。ALL患儿危险度结果:低危型27例、中危型18例及高危型44例。与低危型相比,中危型血浆中TNF-α、高危型血浆中LncRNA RPPH1、TNF-α水平,骨髓中CD34、HLA-DR、CD5及CD19阳性率升高(P<0.05),CD79a阳性率降低(P<0.05)。与中危型相比,高危型患儿血浆中LncRNA RPPH1、TNF-α水平,HLA-DR阳性率升高(P<0.05)。ALL患儿血浆中LncRNA RPPH1、骨髓中CD34、HLA-DR、CD19及CD79a与血浆中TNF-α,LncRNA RPPH1与HLA-DR、CD19关系密切(P<0.05)。结论ALL患儿血浆中LncRNA RPPH1高表达,与免疫表型HLA-DR、CD19关系密切,且与临床危险度、炎症细胞因子关系密切,临床上应该受到重视。

RNase H依赖性PCR技术及其应用研究进展

核糖核酸酶H依赖性聚合酶链反应(rhPCR)在常规聚合酶链反应(PCR)的基础上增加了核糖核酸酶(RNase)H2和封闭式可切割rhPCR引物,消除了反应过程中引物二聚体的形成,同时大大减少了错误扩增的出现,显著提升了反应的特异性、灵敏度和重复性。rhPCR在单核苷酸多态性(SNP)、基因分型、多靶标同时检测、环境核酸检测等方面具有一定的优势。文章从rhPCR的原理、关键技术、技术优点、国内外的应用、发展前景等方面作一综述。

运用计算模拟技术揭示黄芩素抗HIV的新机制(英文)

【目的】运用计算模拟技术,在分子水平揭示黄芩素抗HIV的新机制。【方法】基于药效团和分子对接等数据库搜索方法对抗HIV中药化学成分数据库进行虚拟筛选,得到潜在的抗HIV-1活性化合物;然后,利用分子对接技术得到抑制剂与靶蛋白的最佳结合模式,并从分子水平揭示其作用机制。【结果】虚拟筛选证实黄芩素是HIV-1逆转录酶和整合酶的抑制剂,分子对接显示其作用于HIV-1逆转录酶的核糖核酸酶H区域和整合酶的疏水区域。【结论】黄芩素是一个具有二价金属离子作用机制的、针对HIV-1核糖核酸酶H和整合酶的双重抑制剂。

基于假病毒技术探讨黄芩苷抗HIV-1活性研究

目的:基于假病毒技术探究黄芩苷抗HIV-1活性作用。方法:利用HIV-1骨架质粒NL4-3 mCherry Luciferase、HIV-1包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G和人胚肾细胞HEK-293T构建HIV-1假病毒药物筛选体系,并对该体系进行优化和安全性验证。测定黄芩苷对293T细胞活性、HIV-1假病毒活性、HIV-1逆转录酶(RT)活性、RNA依赖的DNA聚合酶(RDDP)活性以及核糖核酸酶H(RNase H)活性的影响。将黄芩苷分别与HIV-1 RT的晶体结构(2ZD1)、RNase H的晶体结构(3QIN)进行分子对接,探讨黄芩苷与HIV-1 RT、RNase H的相互作用及结合性能。结果:成功构建出了具有双报告检测基因的HIV-1假病毒药物筛选体系,该体系只有单轮感染活性;黄芩苷对293T细胞活性的抑制作用随浓度的增大而增加,黄芩苷在100μmol·L^(-1)浓度以下对293T细胞的活力影响较小(P>0.05);黄芩苷对HIV-1假病毒具有一定的抑制作用,给药浓度越高,其相应的萤光素酶基因和红色荧光基因表达则越低,在100μmol·L^(-1)高浓度下其抑制率可达60%左右;黄芩苷对HIV-1 RT活性和RNase H表现出明显的抑制作用(P<0.05),且呈现浓度依赖性,其半数抑制浓度(IC;)分别约为58.4μmol·L^(-1)、78.4μmol·L^(-1);但黄芩苷对HIV-1 RDDP活性的抑制作用较弱,其IC;约为1.686 mmol·L^(-1);黄芩苷与HIV-1 RT、RNase H蛋白的结合区域均为对应的酶活区域,其分子对接打分值分别为|-10.991|、|-8.485|;黄芩苷能够与HIV-1 RT酶蛋白的LYS101、ILE180氨基酸残基形成氢键作用,与TRP229氨基酸残基形成π-π作用,与VAL106、TYR181、TYR188、VAL108等氨基酸残基形成多个疏水作用;黄芩苷结构母核上的苯环可以与RNase H酶蛋白中的一个Mn;形成一个阳离子-π作用,黄芩苷还能与GLY444、ASP498、GLN500、TYR501氨基酸残基形成氢键作用。结论:黄芩苷在体外具有较好的抗HIV-1活性,其主要的作用靶点为HIV-1 RT和HIV-1 RNase H。

两个Aicardi-Goutières综合征3型家系的产前诊断

本文报道了2个RNASEH2C基因复合杂合变异所致的Aicardi-Goutières综合征3型(Aicardi-Goutières syndrome type 3,AGS3)家系共3例患儿,并于患儿母亲再次妊娠时行产前基因诊断。3例患儿均表现为癫痫、小头畸形、四肢肌张力高及严重的语言、运动、智力障碍。基因分析示家系1先证者及其同胞弟弟RNASEH2C基因存在c.194G>A(p.Gly65Asp)及c.434G>T(p.Arg145Leu)杂合变异,分别遗传自母亲及父亲;家系2先证者RNASEH2C基因存在c.194G>A(p.Gly65Asp)及c.227C>T(p.Pro76Leu)杂合变异,分别遗传自父亲及母亲。结合临床,3例患儿均诊断为AGS3。2个家系患儿母亲再次妊娠行产前诊断,均只检出遗传自胎儿母亲的变异,未检出遗传自胎儿父亲的变异,提示胎儿为携带者,家属选择继续妊娠并足月分娩。随访新生儿至1周岁,生长发育暂未见异常。