单核细胞增生李斯特菌核糖核酸酶RNaseⅢ RncS的表达及其生物学活性研究

为了解单增李斯特菌(LM)核糖核酸酶RNaseⅢRncS的生物学活性,本研究通过PCR方法对该菌LM-SB5野毒株中编码RNaseⅢ的rncS基因进行扩增、克隆及测序并对其进行生物信息学分析;将rncS基因克隆至表达载体p ET-32a(+),转化至大肠杆菌中进行诱导表达。通过体外酶活实验研究目的蛋白对RNA的降解活性。序列分析结果显示,rncS基因全长690 bp,编码229个氨基酸;生物信息学分析结果显示,该基因编码的蛋白含有由9个保守氨基酸(ERLEFLGDA)组成的基序,2个N-酰基化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点,提示该酶蛋白活性受磷酸化的调控。同源性分析显示,LM-SB5 rncS基因编码的蛋白氨基酸序列与LM标准株CAC99883.1的同源性为99.13%。SDS-PAGE检测结果显示,表达的RncS蛋白相对分子量约为42.5 ku,与理论值相符;western blot分析表明重组RncS蛋白具有较强的反应原性。体外酶活实验表明,RncS是一种依赖于二价金属离子的核酸酶,且二价金属离子浓度不同其RNaseⅢ的切割活性则不同。本研究为进一步研究RncS在LM中调控ncRNAs的分子机制奠定前期基础。

单增李斯特菌核糖核酸酶Rnase Ⅲ RncS氨基酸突变对其降解RNA活性的影响

为研究单增李斯特菌(LM)核糖核酸酶Rnase Ⅲ RncS氨基酸突变对RNA降解活性的影响。利用生物信息学软件分析单核细胞增生李斯特菌(LM)野毒株SB5中rncS基因编码的Rnase Ⅲ的结构域,并选择关键氨基酸利用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术对其进行了基因突变;然后将rncS突变基因片段D50A、E122A克隆至表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达;应用SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况及其抗原特异性;通过体外酶活试验研究其对RNA降解活性的影响。结构域分析结果显示,LM-Rnase Ⅲ氨基酸序列含有1个双链RNA结合结构域(DSRM)和1个核酸酶结构域(RIBOc),其中结构域RIBOc含有5个活性位点。SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组突变型Rnase Ⅲ -D50A和Rnase Ⅲ -E122 A蛋白相对分子质量均为42.5 kD,与理论值相符;Western blot分析表明重组突变型Rnase Ⅲ -D50A和Rnase Ⅲ -E122A蛋白可与LM阳性血清发生免疫学反应。体外酶活实验表明,Rnase Ⅲ发挥降解活性依赖于Mn2+或Mg2+,将其第50位天冬氨酸突变后,Rnase Ⅲ RncS的降解活性有所降低(P<0.001);第122位谷氨酸突变后,Rnase Ⅲ RncS降解活性极显著下降(P<0.0001),提示第122位谷氨酸是维持LM Rnase Ⅲ RncS酶活性的关键位点。

核糖核酸酶RnaseⅢ rncS基因缺失对单核细胞增生李斯特菌环境应激的调控作用研究

目的了解核糖核酸酶RnaseⅢrncS基因缺失对单核细胞增生李斯特菌(LM)环境应激和生物被膜形成的影响。方法以LM SB5强毒株为对象,利用温度敏感型穿梭质粒pKSV7,通过基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)和同源重组技术构建LM-ΔrncS基因缺失突变株,检测其在不同温度、pH、高盐、乙醇、H2O2胁迫环境下的适应能力,通过结晶紫染色法检测生物被膜的形成能力。结果与LM-SB5株相比,构建的LM-ΔrncS在37℃、pH 4及pH 7的环境适应能力无显著变化(P>0.05),而在30℃、42℃、pH 9、5%NaCl、3.8%乙醇、0.1%H2O2的应激环境下其适应能力及生物被膜的形成能力显著降低(P<0.05),提示RnaseⅢRncS参与了LM对低温、高温、碱、高盐、乙醇及H2O2胁迫环境的适应过程及生物被膜形成的调控。结论构建的LM-ΔrncS基因缺失突变株,在不同应激环境下的适应能力及生物被膜形成能力均显著降低,为RnaseⅢRncS参与LM ncRNA调控环境应激的分子机制研究奠定了基础。

猪链球菌2型核糖核酸酶Ⅲ的克隆表达及催化特性分析

为了研究猪链球菌2型(SS2)核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)的催化特性,利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达猪链球菌2型RNaseⅢ(SS-RNaseⅢ)并通过镍柱亲和层析的方法分离纯化。异源表达研究显示,重组蛋白RNaseⅢ大部分为可溶性表达;催化特性研究显示,RNaseⅢ主要依赖Mg^(2+)或Mn^(2+)发挥催化功能,并在不同离子浓度和pH值环境下具有不同的催化活性;底物特异性研究显示,RNaseⅢ特异性切割长度为30 bp的双链RNA,同时对内源性的rnc mRNA和5S rRNA具有良好的特异性。上述结果表明,相较于其他细菌RNaseⅢ,SS-RNaseⅢ具有独特的催化特性,为深入理解RNaseⅢ如何介导SS2致病机制奠定了基础。

蛙病毒核糖核酸酶Ⅲ基因结构及其序列分析

对蛙病毒 (TFV)核糖核酸酶Ⅲ基因序列进行分析。TFV基因组中含有完整的核糖核酸酶Ⅲ基因序列 ,全长为 1113bp ,GC含量为 5 6 .6 3%。其推定蛋白质的分子量为 4 0 .4 7kD ,等电点为7.99。序列结构分析发现在编码区的下游有可形成茎环的反向重复序列和形成发夹结构的回文序列。与其它物种相比 ,TFV与虹彩病毒的LCDV 1和CIV的核糖核酸酶Ⅲ基因的氨基酸序列同源性较高 ,与酵母。

rnc基因的高表达及核糖核酸酶Ⅲ的纯化

根据大肠杆菌中核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)含量很低的原因是RNaseⅢ能作用于自身基因(rnc)转录物5'端、负反馈调控其自身合成,设计RNaseⅢ高表达的方案。去除rnc基因5'侧能转录生成可被RNaseⅢ降解的RNA结构的序列,保留整个rnc基因及其5'侧的天然翻译起始序列,将之置于λP_L启动子控制下,所构建的质粒在大肠杆菌中经诱导后高表达出RNase Ⅲ,其含量达细胞总蛋白质量的65%以上,并在菌体内形成包涵体。利用RNaseⅢ溶解度变化的特点,在低温、低盐条件中裂菌,并洗涤沉淀,在室温、高盐条件下溶解、过Q-Sepharose FF柱,获得具有良好活性、电泳纯的RNase Ⅲ,收获量为10—12mg/100ml培养液。同时还发现RNase Ⅲ具有特异性结合ATP的活性。

干旱胁迫对小麦叶片核糖核酸酶活力及合成的影响

干旱协迫下，抗旱（陕合６号）与干旱敏感（郑引１号）小麦品种叶片中的核糖核酸酶活性均有所增加，增加幅度与其相对含水量变化呈显著负相关。１４Ｃ－Ｌｅｕ掺入后，样品粗提液经ＰＡＧＥ分离并染色，发现干旱处理叶片的两个低分子女（１２ｋＤ、１７ｋＤ）具ＲＮａｓｅ活性的蛋白质的放射性掺入总量低于对照，但占总蛋白的放射性比例高子对照，证明干旱胁迫下存在ＲＮａｓｅ的从头合成（ｄｅｎｏｖｏｓｙｎｔｈｓｉｓ）。讨论了胁迫下ＲＮａｓｅ活性增加的原因。

水稻核糖核酸酶T2蛋白质在叶片生长和盐胁迫过程中的表达研究

核糖核酸酶(Ribonucleases,RNase,RNS)T2普遍存在于各种生物中,其保守性提示了功能的重要性。在水稻基因组中有8个RNase T2成员,本试验采用基于抗体的蛋白质组学策略,用免疫印迹(Western Blotting,WB)技术检测了它们在叶片生长及盐胁迫条件下的表达,发现OsRNS1-OsRNS7蛋白质在叶片中有表达,其中OsRNS4主要在苗期表达,提示其在苗期发挥作用,其它蛋白质主要在成株期表达,但没有检测到OsRNS8的表达;水稻OsRNS4在盐胁迫条件下表达上调,提示其可能在盐胁迫应答过程中发挥作用,其它RNase T2蛋白质的表达大多随盐胁迫时间的延长而下降。将RNase T2蛋白质的表达与转录信号进行比较,发现二者在部分基因中有一定的相关性。本试验获得的数据为揭示水稻RNase T2基因的功能提供了线索。

小麦及其近缘物种中小分子量核糖核酸酶的初步分析

应用ＲＮａｓｅ功能胶体系，在小麦及其相关物种中发现１组小分子量核糖核酸酶（ＲＮａｓｅ）。ＲＮａｓｅ的分子量变化范围在６５～１４ｋＤａ间，低于已报道的大多数植物ＲＮａｓｅ的分子量。小分子量ＲＮａｓｅ在幼苗中大量表达，并且在降解ＲＮＡ底物时，随着缓冲液ｐＨ值及离子浓度的不同而有所变化。在休眠及发芽小麦种子中发现几种可能不同的小分子量ＲＮａｓｅ。在发芽过程中，其中２种ＲＮａｓｅ的活性变化不明显，而另外２种ＲＮａｓｅ却分别表现出一种逐渐减弱和增强的趋势。

鳜传染性脾肾坏死病毒核糖核酸酶III基因结构及序列分析

测定了鳜传染性脾肾坏死病毒 (ISKNV)核糖核酸酶III(RNaseIII)基因的核苷酸全序列。该基因完整读码框为 771bp ,GC含量为 5 2 .5 3% ,编码一个长为 2 5 6个氨基酸、分子量为 2 8.9kD的推定蛋白。其上下游序列各有一个TATAbox ,终止子下游有一段回文序列。与其它物种相比 ,ISKNV与虹彩病毒 (包括LCDV - 1和CIV)的核糖核酸酶III基因的氨基酸序列同源性较高 ,与酵母。

乙型肝炎病毒靶向核糖核酸酶及其突变体的原核表达和活性分析

目的:研究原核表达的乙型肝炎病毒(HBV)靶向核糖核酸酶(RNase)及其突变体(点突变失去RNase活性)的活性。方法:将构建的靶向核糖核酸酶及其突变体基因克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导融合蛋白(HBV核心蛋白与人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素的融合蛋白)的表达;表达产物经包涵体纯化、SDS-PAGE和Western印迹鉴定,将纯化的蛋白用透析方法复性;以酵母tRNA为作用底物,应用复性的蛋白进行RNase活性分析。结果:纯化和复性了HBV靶向核糖核酸酶及其突变体;复性的HBV靶向核糖核酸酶可以降解酵母tRNA且具有剂量依赖性,而复性后的突变的靶向核糖核酸酶体不具有RNase活性。结论:原核表达的HBV靶向核糖核酸酶具有较强的RNase活性,为探索HBV靶向核糖核酸酶抑制乙肝病毒复制的机理奠定了基础。

核糖核酸酶及其临床意义

核糖核酸酶（EC 2.7.7.16,Ribonuc-lease,RNase）的系统名为聚核苷酸-α-寡核苷酸转移酶。该酶具有环化作用,能使核糖核酸（RNA）解聚,也能使某些人工合成的寡核苷酸如聚胞苷酸（Poly C）分解,是具高度特异性的核酸内切酶。RNase只水解核苷酸序列中的嘧啶核苷酸C3’磷酸基与下一个核苷酸C5’相连的键。其作用特点是,

核糖核酸酶及其在胰腺癌诊断中的应用

核糖核酸酶胰型同工酶因来源于胰腺并特异水解聚胞嘧啶核苷酸(poly C)而被简称为RNase C。RNase C水解Poly C分子内的磷酸二酯键,其水解产物3’-单胞苷酸(3’-CMP)溶于酸并在278nM处形成最大光吸收峰。动物实验表明RNase C在胰腺癌早期即明显升高,并与癌直径呈明显正相关(r=0.92)。RNase C诊断人胰腺癌的敏感性和特异性分别达到90%,因而有可能成为筛选胰腺癌和判断其预后的一项有价值的指标。

浙江产中华眼镜蛇(Naja naja atra)毒核糖核酸酶的研究

本文报道了关于浙江产眼镜蛇(Naja naja atra)毒RNase(简称RNaseZ.)的分离提纯和性质的研究。经亲和层析去胆碱酯酶的蛇毒溶液,通过SP-Sephadex C-25柱层析和Sephadex G-75凝胶过滤,可得到一种高纯度的RNaseZ.制剂,其比活提高了67倍,总活力回收为21%。RNaseZ.最适pH为11左右,Mg^(2+)与K^(+)为其激活剂,Ca^(2+),Zn^(2+),Cu^(2+),Mn^(2+)及EDTA均为抑制剂,巯基乙醇则对其无作用。RNase Z.能迅速降解CPV dsRNA,酵母tRNA,poly(A),poly(C),poly(I),poly(U)及poly(I).poly(C),但不能降解DNA。RNaseZ.降解酵母tRNA的主要产物为4~8核苷酸,降解[5’—^(32)P)pCpUpCpGpUpCpCpA后所得到的标记产物为[5’-^(32)P)pCpU。因此,RNase Z.为一种能作用于ssRNA和dsRNA并产生具5’-磷酸单酯结构的寡核苷酸的内切核糖核酸酶。

牛胰核糖核酸酶结晶的制备

牛胰核糖核酸酶(E.C 2.7.7.16)首先由Kunitz用硫酸铵分级盐析的方法获得结晶,然而在多次重结晶后仍含有微量蛋白水解酶的活性。McDonald利用加热的方法除去这些掺杂的蛋白质后,得到了无蛋白水解酶活力的纯牛胰核糖核酸酶结晶。随后,Hirs等将结晶RNase在IRC-50(XE-64)的树脂上层析分离,分出A及B二个组分,比例为10:1。Taborsky将结晶RNase在CM-纤维素上层析,得到一个主峰和三个小峰,都具有酶活力,主峰相当于RNase A。

RNaseⅢ RncS对单核细胞增生李斯特菌毒力的调控作用研究

核糖核酸酶RnaseⅢ是一种调控nc RNA水平的重要酶系。为了解核糖核酸酶RnaseⅢRncS在单核细胞增生李斯特菌(LM)毒力中的调控作用,本研究在构建LM-ΔrncS基因缺失突变株的基础上,通过动物感染试验检测强毒株LM-SB5与缺失株LM-Δrnc S对昆明系小鼠的LD50、存活能力、脏器载菌量及病理组织学产生的影响;利用细胞侵染试验检测强毒株与缺失株对小鼠巨噬细胞RAW264.7的粘附率、侵袭率及其在胞内生存繁殖能力的影响,分析RnaseⅢRncS对LM毒力的影响。结果显示,LM-SB5强毒株和LM-Δrnc S缺失株对昆明系小鼠的LD50分别为105.60 CFU、106.90 CFU;与LM-SB5强毒株相比,LM-Δrnc S的LD50升高了1.30个对数数量级,小鼠的存活时间明显延长,表明毒力显著降低;第3~5 d肝脏、脾脏载菌量显著减少(P<0.05),其中第4 d差异极显著(P<0.01);LM-Δrnc S缺失株对肝脏、脾脏、肾脏的病理损伤降低;LM-Δrnc S缺失株对RAW264.7细胞的粘附率和侵袭率均显著低于LM-SB5强毒株(P<0.01),在2~6 h之间,LM-Δrnc S缺失株在细胞内的细菌量显著低于LM-SB5强毒株(P<0.05),证实LM-Δrnc S在细胞内的生存增殖能力显著降低,提示rnc S基因对LM毒力发挥有一定的调控作用。本研究为进一步揭示RnaseⅢ在LM毒力中的分子调控机制提供了科学依据。

苹果梨树花芽分化期核糖核酸酶(RNase)活性变化的研究

本文分析了苹果梨树短、长枝叶片在花芽分化期核糖核酸酶活性的变化规律。结果表明：核糖核酸酶活性在花芽分化前期逐渐增高并达到最大值，生理分化期逐渐下降，进入形态分化期后开始上升，到花原基大量分化时出现一个峰值。指出核糖核酸酶活性在花芽分化期起了一定的促进作用。为进一步探讨遗传物质对果树花芽分化的作用及二者的关系研究提供参考数据。

古细菌RNase HⅡ与金属离子结合的热力学研究

ＲＮａｓｅ Ｈ是一种专一性水解 ＲＮＡ：ＤＮＡ杂合链中 ＲＮＡ链的核糖核酸酶，它广泛存在于从原核生物到人的生物体中．本文通过等温滴定量热技术研究了Ｍｇ２＋，Ｍｎ２＋和 Ｃａ２＋与一种古细菌 Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ中的Ⅱ型 ＲＮａｓｅ Ｈ结合的热力学．首次用这种方法获得了这一结合过程的热力学参数．并证实了这些金属离子与ＲＮａｓｅ ＨＩＩ按１：１结合．为ＲＮａｓｅ ＨＩＩ酶反应机理和折叠研究提供了重要信息．

RNase和DNase生物学功能研究的新进展

核糖核酸酶作为一种模型蛋白被普遍用于分子生物学研究。近年来的一系列研究明，核糖核酸酶及其结构类似物具有许多重要的生物学功能，如控制肿瘤血管生成、抑制病毒的复制、RNA干涉等，引起人们的广泛关注。我们将对有关核糖核酸酶和脱氧核酶家族生物学功能的新发现及研究进展作一介绍。

核糖核酸酶超家族A对感染病病原体的抑制

哺乳动物核糖核酸酶超家族A （ribonuclease A superfamily,RNase A）是最早在牛胰腺细胞中发现的一类具有RNA切割、血管生成、介导天然免疫等多种生物学功能的相对分子质量较小的蛋白,成熟的蛋白相对分子质量为14×103～16×103,包含6～8个半胱氨酸残基,部分蛋白拥有与其酶解功能相关的结构域[1].该家族是目前人类基因组发现的唯一“脊椎动物”特有的酶家族,它们的基因均位于14q11.2上,各亚分子的基因序列存在高度相似性,在已经明确结构的亚分子中均发现存在二硫键[1].