应用核素标记相对和绝对定量技术结合纳升液-质联用筛选养血清脑颗粒对斑马鱼神经损伤预后的生物标志物

目的分析斑马鱼神经元模型损伤给药治疗前后总蛋白差异,寻找养血清脑颗粒对斑马鱼神经元损伤预后的生物标记物及其作用机制。方法采用核素标记相对和绝对定量技术结合纳升液相色谱和串联质谱(Nano LC-MS/MS)对给药前后斑马鱼药效模型总蛋白进行分离并分析肽段,采用Proteinpilot 4.2软件对蛋白进行鉴定和定量分析,对获得的差异蛋白进行生物信息学分析,应用蛋白印迹法对可能的生物标记物进行验证。结果通过Nano LC-MS/MS分析鉴定出置信度>95%的蛋白质共1 933种,其中总差异表达蛋白质130种,模型组与模型给药组表达量上调≥1.5倍的蛋白质有9种,下调≤0.70倍的蛋白质有23种。通过GO分析显示,差异蛋白的分子功能主要集中在神经元离子通道的翻译和代谢过程;Western blot结果显示,与模型组相比,差异表达蛋白Ef1-α(elongation factor 1-alpha)和α-6-F(Na^+/K^+ transporting ATPase alpha 1 polypeptide)在给药后表达量下调,差异具有统计学意义(P<0.05),且与质谱结果一致。结论 iTRAQ联合Nano LC-MS/MS技术能高通量地筛选斑马鱼神经元损伤相关蛋白,初步阐述养血清脑颗粒对斑马鱼神经元损伤预后的作用机制。

应用核素标记相对和绝对定量技术对大鼠急性脊髓损伤的蛋白组学研究

急性脊髓损伤（ASCI）是一种严重的神经系统创伤，是致残的主要病因之一。我们应用核素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术探索SD大鼠ASCI后0h和6h的脊髓差异蛋白的表达。

利用同位素标记相对和绝对定量技术筛查神经管畸形胚胎孕鼠血清差异蛋白质谱

目的筛查神经管畸形相关血清标记物,为阐明神经管畸形的发病机制提供理论依据。方法应用维甲酸在大鼠神经管闭合的关键期(孕10 d,E10)给药,建立脊柱裂大鼠模型,选取致畸早期孕11、13 d (E11、E13)显性脊柱裂胚胎孕鼠和正常胚胎孕鼠血清各5例,应用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)和液相色谱质谱鉴定技术分析2组蛋白质,定量信息以蛋白的丰度比差异倍数1.5倍以上(P <0.05)为差异蛋白质。结果质谱共得到谱图157 422张,鉴定出390种蛋白质,发现E11维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白40种,E13维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白26种。结论筛选出致畸早期大量神经管畸形和正常孕鼠血清差异蛋白,差异蛋白通过直接或间接相互作用,促进或抑制神经管畸形的发生与发展。

同位素标记相对和绝对定量技术在药物蛋白质组学研究中的应用

目的建立应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术进行药物蛋白质组学研究的技术平台。方法分别测定12例高血压患者在给予降压药氨氯地平治疗前和治疗后8周的收缩压和舒张压,并同时收集患者在降压药治疗前和治疗后8周的血清,应用蛋白质组学iTRAQ技术对治疗前后的血清蛋白质组进行定量分析。结果高血压患者口服降压药苯磺酸氨氯地平片8周后平均收缩压和舒张压均明显降低(P<0.01)。经iTRAQ和ProteinPilot软件分析,共鉴定出232个差异蛋白质,其中降压药物治疗后表达上调和下调超过1.5倍的蛋白质分别有12种和13种。上调的蛋白质主要参与应激、防御和免疫反应,而下调的蛋白质主要参与应激、防御、炎症和凝血反应。本研究结果提示,降压药氨氯地平治疗可以双向调节机体的应激和防御反应,可以增强机体的免疫力,抑制炎症反应和改善高血凝状态,从而有利于血压的降低。结论应用iTRAQ技术进行药物蛋白质组学研究可筛选获得多种与药物疗效相关的差异蛋白质,为药物作用靶点和分子机制等方面的研究提供了一个良好的技术平台。

基于同位素相对标记与绝对定量技术结合质谱技术的幼年特发性关节炎血清蛋白质组学研究

目的应用同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)分析幼年特发性关节炎(JIA)患者与健康人群的血清差异蛋白。方法收集JIA患者血清18例、健康体检者20例、类风湿关节炎(RA)患者44例,采用iTRAQ标记联合纳升液相色谱-串联质谱筛选JIA患者的差异蛋白,并进行生物信息学分析。结果相对于健康体检组,JIA组共鉴定差异蛋白106个,其中49个表达上调,57个表达下调;JIA组和RA组中有26个差异蛋白均表达上调,37个表达下调。通过GO富集分析和KEGG通路分析,结果表明血液凝溶系统、免疫系统、脂质代谢与JIA的发病机制密切相关。通过STRING分析得到研究JIA机制的PPI网络的关键节点AHSG、APOH、脂联素等多个候选蛋白。结论本研究分析了JIA患者的血清蛋白质组,为JIA的诊断、JIA发病机制的探讨提供了实验依据。

出口梗阻型便秘病人的差异表达蛋白及其生物学功能-基于同位素标记相对和绝对定量的蛋白质组学研究

目的分析出口梗阻型便秘(ODS)病人病变直肠组织的差异表达蛋白及其生物学功能。方法纳入ODS病人20例、混合痔脱垂病人(无便秘症状)10例,所有病人均行经肛门吻合器直肠切除术并收集手术切除直肠标本。利用同位素标记相对和绝对定量技术筛选ODS病人与混合痔脱垂病人之间的差异表达蛋白谱,并对所有的差异表达蛋白进行基因本体论(GO)分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析和信号肽(SignalP)分析。结果ODS病人与混合痔脱垂病人之间差异表达蛋白共164个(表达上调88个,表达下调76个),涉及的生物过程主要包括细胞过程、生物调节、代谢过程等,涉及的细胞组成主要包括生化过程、细胞结构等,涉及的分子功能主要包括结合位点、催化活性、分子功能调节等。涉及的信号通路主要包括神经退化疾病、内分泌与代谢疾病及免疫疾病等。结论ODS病人与非便秘病人直肠组织蛋白存在差异,差异表达蛋白所参与的生物学过程及涉及的信号通路可能参与ODS发病机制。

同位素标记相对和绝对定量评价非创伤性股骨头坏死患者的血清蛋白组学分析

背景:非创伤性股骨头坏死是一类以髋关节疼痛、功能障碍进行性加重为主要症状的疾病,严重危害人体健康。它的发病机制、早期诊断和治疗仍是临床骨科医生所面临的重大挑战。目的:采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术,用蛋白质组学筛选可能与非创伤性股骨头坏死相关的关键蛋白。通过分析这些蛋白的表达特性及潜在的生物学功能,为进一步研究非创伤性股骨头坏死病因及分子机制奠定基础。方法:提取非创伤性股骨头坏死患者和健康人血清蛋白,应用iTRAQ技术标记蛋白,联合液相色谱和串联质谱分离和分析肽段。采用Proteome Discoverer 2.1软件对两组人群蛋白进行鉴定和定量分析,获得差异蛋白,再对这些表达差异蛋白进行GO注释、KEGG通路注释和功能富集聚类分析。结果与结论:①质谱鉴定共得到1006个蛋白,通过分析得到137个差异表达蛋白,其中54个蛋白表达上调,83个蛋白表达下调;②与非创伤性股骨头坏死发生相关的表达差异显著的蛋白质包括载脂蛋白B(ApoB)、载脂蛋白A2(ApoA2)、载脂蛋白E(ApoE)、补体C4和C7等;③KEGG信号通路富集分析结果显示,关键靶点的主要信号通路为p53信号通路、转录生长因子β信号通路、扩张型心肌病信号通路;④该结果提示,载脂蛋白与非创伤性股骨头坏死发生密切相关,并发现了与非创伤性股骨头坏死相关的活跃信号通路,为非创伤性股骨头坏死发生及分子机制奠定一定的实验基础。

同位素标记定量技术评估肾病综合征尿液蛋白质谱变化的初步探讨

目的旨在通过同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术分析原发性肾病综合征(PNS)患者尿液差异表达蛋白,寻找高特异性、无创性评估PNS的病理损害标记蛋白,并结合相应蛋白功能探讨其在PNS发病机制及疾病进展中的作用。方法 9例PNS患者肾穿刺当日和3例健康人的晨尿标本经毛细管高效液相色谱仪分离后,Q-Exactive质谱仪进行质谱分析,Maxquant 1.4.1.2和persus 1.4.1.3软件进行查库鉴定、定量和数据分析。结果成功得到PNS尿液蛋白SDS-PAGE电泳图谱,并得到724个蛋白质组,其中≥2的唯一肽段308个,定量、查库鉴定和数据分析最终得到差异蛋白表达明显的19个。其中与3例健康对照患者差异表达的蛋白3个,包括抗胰蛋白酶(AAT)、抗胰凝乳蛋白酶(AACT)和微管蛋白酪氨酸连接酶类似物7。结论 i TRAQ技术评估PNS尿液蛋白质组变化具有现实可行性,可以用于更深入的研究。

苦马豆素对家兔脾脏免疫功能及代谢的影响

为了探讨苦马豆素通过消化系统对家兔脾脏免疫功能和代谢的影响,将体重为(1.9±0.12)kg的24只家兔随机分成对照组与试验组,每组雌、雄各半。试验组家兔饲喂含有小花棘豆的自制颗粒饲料,饲喂苦马豆素剂量为2 mg/(kg·d),对照组家兔饲喂自制颗粒饲料中不含小花棘豆。所有家兔单笼饲养,自由饮水,每天观测并记录家兔的健康状态。在试验的第60天,采取所有家兔脾脏,对脾脏进行基于iTRAQ的定量蛋白质组学分析、生物信息学分析及关键蛋白质的Western blot验证。结果显示,所有试验组家兔均呈现明显的中毒现象。与对照组相比,共鉴定出315个与新陈代谢(81%)及免疫相关(15%)的差异表达蛋白质(>1.5倍或<1/1.5倍)。而且,苦马豆素中毒家兔脾脏细胞分解代谢处于激活状态,但其免疫反应处于抑制状态。说明苦马豆素抑制了家兔脾脏的免疫功能,激活了脾脏组织的分解代谢。

基于转录组和同位素标记相对与绝对定量技术的宽体金线蛭生品和烫制品差异蛋白研究

目的:通过转录组和蛋白质组技术研究宽体金线蛭生品和炮制品的差异蛋白。方法:以活体宽体金线蛭(Whitmania pigra Whitman)为原料,基于无参转录组进行基因分析,利用转录组信息匹配到Helobdella robusta蛋白质库,然后利用同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)蛋白组学技术进行宽体金线蛭的蛋白成分分析,筛选出存在于宽体金线蛭生品及炮制品中的差异蛋白质,并对其进行基因本体(GO)功能聚类分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析以及蛋白质相互作用网络分析(PPI),并结合BIOPEP数据库筛选可能具有抗凝活性的蛋白。结果:本研究筛选到差异表达蛋白共112种,其中78种上调蛋白、34种下调蛋白,并推定出6条可能具有抗凝作用的差异蛋白。GO功能聚类分析结果表明,在细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)条目富集的差异蛋白数量最多。在差异性方面,大分子复合物(macromolecular complex)、结构分子活性(structural molecule activity)条目差异最显著。KEGG富集分析结果表明,差异蛋白在代谢途径(metabolic pathways)富集到的蛋白最多,ECM-受体相互作用(ECM-receptor interaction)、核糖体(ribosome)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)差异最显著。结论:本研究结合转录组、蛋白组数据,补充了宽体金线蛭的蛋白质库,筛选出了生品及烫制品的差异蛋白并推定了可能具有抗凝作用的差异蛋白,为宽体金线蛭基因组成、物质基础研究及炮制机制提供参考依据。

基于同位素标记相对和绝对定量技术研究耐铬(VI)菌株CM01的蛋白定量组学

【背景】六价铬[Cr(VI)]作为一种高毒性的重金属污染物,用微生物学方法还原Cr(VI)既经济又环保。【目的】探究耐铬菌株CM01中与耐受或还原铬Cr(VI)有关的蛋白或基因,从分子水平上阐述其耐铬Cr(VI)机制。【方法】运用同位素标记相对和绝对定量技术(isobarictagsforrelativeand absolute quantitation techniques,iTRAQ)分析耐铬菌株CM01在有无铬Cr(VI)胁迫下的蛋白表达差异。运用RT-qPCR技术验证4种与代谢途径有关的上调蛋白的m RNA表达量。运用紫外分光光度计测定细胞表面疏水性。【结果】共鉴定到2570个蛋白,其中存在显著差异的蛋白数为646个,上调蛋白数量343个,下调蛋白数量303个。CM01中的Fe/Mn超氧化物歧化酶、甜菜碱醛脱氢酶、磷酸戊糖途径、磷酸肌醇代谢途径、氨基酸代谢共同参与了菌株对于外源性Cr(VI)的响应机制。RT-qPCR实验结果表明,与代谢途径有关的4种蛋白其基因转录水平和蛋白水平一致。对照组CM01的细胞表面疏水性高于实验组。【结论】初步探索了耐铬菌的Cr(VI)响应机制,为利用微生物治理环境污染提供了理论支持和新的研究思路。

应用iTRAQ多重化学标记串联质谱技术筛选晚期卵巢浆液性腺癌组织中卡铂耐药相关蛋白

目的利用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术筛选晚期卵巢癌组织中卡铂耐药相关差异表达蛋白,为临床个体化治疗奠定实验基础。方法收集Ⅲ期低分化卵巢浆液性腺癌标本并通过ATP-TCA药敏试验检测卡铂敏感度。取卡铂敏感和耐药标本各15例,iTRAQ试剂标记,被标记的肽段进行高效液相色谱(HPLC)分离及质谱检测(MS)。结果共鉴定出iTRAQ标记定量信息有755个显著差异表达的蛋白。卡铂耐药组与卡铂敏感组相比,上调1.2倍以上的蛋白429个;下调0.83倍以下的蛋白326个。上调蛋白中有osteopontin(OPN)、clusterin(CLU)、5'-nucleotidase(CD73)和tissue inhititor of metalloproteinases 1(TIMP1)等18个蛋白与肿瘤恶性行为及化疗耐药相关。结论应用iTRAQ技术能筛选出多种与晚期卵巢癌卡铂耐药相关的差异表达蛋白,该技术对于肿瘤组织蛋白质组学的研究有很好的应用前景。

iTRAQ多重化学标记串联质谱技术在生命科学领域中的应用

同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术—利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团,经高精度质谱仪串联分析,可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量,是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术,正迅速被广大学者所接受。主要从iTRAQ实验技术概要、iTRAQ多重化学标记串联质谱技术在生命科学领域中的应用、问题与展望等三个方面进行简要总结。

激光捕获显微切割技术纯化的人支气管上皮癌变各阶段组织的定量蛋白质组学研究

为分析支气管上皮癌变进程中的差异表达蛋白质,筛选肺鳞癌早期诊断标志物,以人支气管上皮癌变各阶段组织为研究对象,先采用激光捕获显微切割技术(LCM)纯化人正常支气管上皮组织、鳞状化生、不典型增生、原位癌、浸润性肺鳞癌组织,再用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术结合二维液相色谱串联质谱(2D LC-MS/MS)鉴定支气管上皮癌变进程中各阶段的差异表达蛋白质.结果共鉴定了1 036个蛋白质,筛选出102个与人支气管上皮癌变相关的差异蛋白质,在这些差异蛋白质中,有的在支气管上皮癌变过程中进行性上调,有的在支气管上皮癌变过程中进行性下调,有的呈阶段特异性改变.功能分析表明,这些差异蛋白质涉及代谢、细胞凋亡、增殖、分化、信号传导、转录、翻译、细胞黏附、免疫反应与发育等.Western blotting及免疫组织化学技术验证了其中2个差异蛋白(S100A9和CKB)的表达,证实了定量蛋白质组学结果的可靠性.研究结果提示:这些差异表达蛋白质与支气管上皮癌变相关,并可成为肺鳞癌的早期诊断标志物,进一步研究差异蛋白质的生物学功能,将有助于阐明支气管上皮的癌变机制,从而为肺鳞癌的早期诊断与发病机制研究提供新思路.

基于同位素标记相对和绝对定量技术的联合用药抗肝纤维化作用的蛋白质组学研究

目的以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、牛磺酸和染料木素3种具有不同抗纤维化作用的药物组成联合用药,应用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术研究联合用药对肝纤维化大鼠治疗作用的蛋白质基础及分子机制。方法将SD大鼠分为对照组、模型组和联合用药组,模型组和联合用药组大鼠分别ig 50%CCl4溶液,对照组给予花生油,连续14周。于第9周开始联合用药组进行ig给药(牛磺酸200 mg/kg+EGCG 30 mg/kg+染料木素20 mg/kg)治疗,连续6周。采集大鼠血清和肝组织样本,肝组织进行HE染色观察病理变化,模型组和联合用药组血清样本组内等量混合后去除高丰度蛋白,i TRAQ试剂标记后应用液相色谱分离,经质谱鉴定,进行相对定量及生物信息学分析,用ELISA法对有代表性的血清差异蛋白Txn1进行验证。结果质谱鉴定出置信度在95%以上的蛋白质共359个,其中差异表达的蛋白有78种,上调的蛋白有51种,下调的有27种。与模型组相比,差异蛋白Txn1在联合用药组血清中的量明显升高(P<0.05)。结论联合用药能通过对多个蛋白质、多途径的综合调节达到抗肝纤维化的效果,其中对抗氧化防御系统和血液凝固级联活化途径的调节可能是联合用药抗肝纤维化作用的分子机制。

基于相对和绝对定量同位素标记技术对肥胖大鼠海马区差异蛋白组学的研究

目的筛选及鉴定肥胖大鼠海马区的差异蛋白表达。方法将24只SD大鼠随机分为单纯肥胖组(Ob,n=14)及正常对照组(NC,n=10)。予高脂高糖饮食制备单纯肥胖大鼠模型,采用相对和绝对定量同位素标记技术(iTRAQ)联合二维液相色谱-串联质谱(2D-LC-MS/MS)法鉴定肥胖大鼠海马区差异蛋白表达,对所获蛋白行生物信息学分析,Western blot法对筛选的部分差异蛋白进行验证。结果成功建立单纯肥胖大鼠模型,共鉴定出310种差异蛋白表达。于KEGG数据库检索筛选出26个差异蛋白显著富集的代谢通路。选取位于蛋白功能相互作用网络交叉点的4种差异蛋白行Western blot验证,发现蛋白表达水平与质谱结果一致。结论采用iTRAQ结合2D-LC-MS/MS技术,能有效筛选肥胖大鼠海马区差异蛋白表达,为研究肥胖对中枢神经系统损伤机制提供依据。

iTRAQ多重化学标记串联质谱技术在蛋白质组学中的应用

i TRAQTM是2004年美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation,ABI)最新推出的一种多肽体外标记试剂,该技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究,具有较好的定量效果、较高的重复性,并且弥补了DIGE及ICAT的不足,正迅速被广大学者所接受。主要从i TRAQ实验原理、实验流程、i TRAQ与其他定量蛋白质组学方法的比较等3个方面进行简要总结。

同位素标记相对和绝对定量技术筛选的相关差异蛋白在重症肺炎患儿心肌损害和心力衰竭诊断中的临床价值

目的探讨应用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)筛选的相关差异蛋白在重症肺炎患儿并心肌损害和心力衰竭诊断中的临床价值,为临床诊治提供参考依据。方法通过强阳离子交换色谱分析法的8种不同同位素标记的iTRAQ和液相色谱法以及串联质谱分析重症肺炎患儿(观察组)和健康儿童(对照组)血清蛋白。通过Mascot软件分析和GO分析表达差异的蛋白。结果与对照组相比,观察组中共鉴定出有定量信息的蛋白质89个,包括61个上调蛋白和28个下调蛋白。生物信息学分析显示差异表达的蛋白主要参与急性期反应、氧运输活动及酶催化等过程,这些表达差异的蛋白中选择5个显著表达差异作为候选蛋白,分别是CRP、SAA、PI16、BLVRB、G3P。结论本研究发现这5种蛋白在小儿重症肺炎并发心肌损害和心力衰竭过程中发挥重要作用,可能作为该病潜在的临床筛查生物标志物。

相对和绝对定量同位素标记技术在肝细胞癌蛋白质组学中的应用研究进展

肝细胞癌以其异质性强、早期诊断难、预后不良和致死率高等特点，成为危害我国国民健康的重要疾病。准确的早期诊断对于提高肝癌切除手术的成功率和降低术后复发与转移至关重要，其关键是早期诊断生物标志物的筛选和验证。以同位素标记相对和绝对定量技术、基于预定同位素标记氨基酸的细胞培养技术等为代表的定量蛋白质组学技术是蛋白质组学技术重要的组成部分，其中前者因其通量高、定量精度高、不受样品来源限制等优势成为定量蛋白质组学技术中的支柱型技术。现就该技术在肝细胞癌发生、发展过程的分子机制及其标志物的筛选研究进展进行综述，为深入理解肝细胞癌发生发展的分子机制和这些新发现的生物标志物的开发创造条件。

同位素标记相对和绝对定量技术在RA患者血清中的应用研究

采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术寻找能够用于RA诊断、疗效评估或预后判断的新血清标志物,探索RA发病机制。对10例活动期RA患者、10例稳定期RA患者与10例健康对照者血清采用iTRAQ技术结合串联质谱技术进行差异蛋白质组学分析,得到差异蛋白。通过DAVID软件鉴定差异蛋白,分析差异蛋白在RA发病过程中所起的生物学作用。结果显示共鉴定出303个蛋白质,其中RA活动组与健康对照组差异倍数≥1.5的蛋白质27个,表达显著上调和下调的蛋白质分别为13和14个,差异蛋白的功能涉及到蛋白质代谢、脂类代谢、补体系统、凝血系统等多个系统。通过DAVID软件的在线分析得到了差异蛋白的基因本体论(gene ontology, GO)生物学过程、细胞组分和分子功能的富集分析结果。通过对差异蛋白的研究可以为阐明RA的发病机制及发现新的生物标志物提供新的途径。