核纤层蛋白A/C基因Glu82Lys突变与扩张型心肌病

目的 检测中国人家族性扩张型心肌病核纤层蛋白A/C(Lamin A/C)基因突变情况。方法对1个扩张型心肌病家系进行核纤层蛋白A/C、基因突变扫描,聚合酶链反应(PCR)扩增核纤层蛋白A/L’基因1～12号外显子,测序检测突变。对照为60例正常人及9例无明显家族史的扩张型心肌病伴传导阻滞病人。结果 该家系先证者第1号外显子PCR产物测序分析表明该患者核纤层蛋白A/C基因第82密码子位置发生G→A转换,使谷氨酸(Glu)变为赖氦酸(Lys)。该患者临床表现劳力性呼吸困难、心动过缓、胸闷、夜间不能平卧,超声示左心室扩大,心电图显示Ⅲ°房室传导阻滞,现已安装起搏器治疗。患者母亲及哥哥皆有相似临床症状且都已于40余岁心衰死亡,其家属有多人死于相同症状。结论 核纤层蛋白A/C基因Glu82Lys错义突变位于核纤层蛋白的杆状结陶域,有氨基酸的极性改变,该突变表型呈现症状重,发病早,预后差的临床特点,台并Ⅱ-Ⅲ°传导阻滞,提示该突变是致扩张型心肌病的恶性突变。

LMNA突变体HEK293、C2C12模型的构建及其核纤层蛋白A/C亚细胞定位

目的构建A型核纤层蛋白基因(LMNA)野生型、突变体的融合蛋白真核表达载体及LMNA突变体慢病毒载体,研究其在HEK293、C2C12中表达、核纤层蛋白A/C亚细胞定位及细胞核改变。方法将野生型全长LMNA cDNA克隆入pEGFP-N1质粒,构建LMNA野生型质粒pEGFP-N1-LMNA,以野生型质粒为模板构建c.1117A>G定点突变质粒pEGFP-N1-LMNA-I373V。将构建的2种质粒分别转染HEK293、C2C12,用G418筛选转染的C2C12,荧光显微镜下观察细胞核形态及GFP标记的核纤层蛋白A/C亚细胞定位。以pEGFP-N1-LMNA-I373V为模板,构建pHBLV-h-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO慢病毒,对慢病毒进行包装与滴度测定。pHBLV-GFP-PURO、pHBLV-LMNA-C1117-3*flag-GFP-PURO分别转染C2C12,免疫荧光染色法观察转染后细胞核形态及核纤层蛋白A/C亚细胞定位的改变。结果构建的pEGFP-N1-LMNA、pEGFP-N1-LMNA-I373V及pHBLV-h-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO测序与目的基因序列完全一致。pEGFP-N1-LMNA转染的HEK293、C2C12核纤层蛋白A/C均匀表达于核膜下,pEGFP-N1-LMNA-I373V转染的HEK293、C2C12内核纤层蛋白A/C核内异常聚集,呈散点样分布;与HEK293相比,C2C12细胞转染效率明显降低。慢病毒转染C2C12的转染率高,突变体慢病毒转染的细胞核形态异常及核纤层蛋白A/C核内分布异常。结论成功构建2种LMNA突变体真核表达载体及突变体转染的HEK293、C2C12模型,为LMNA突变体导致疾病的机制研究奠定科学基础。

小鼠胸腺T淋巴细胞有丝分裂过程中核纤层蛋白A/C与染色体结合

核纤层(nuclear lamina)是内层核膜下由10nm纤维构成的网架,是核骨架的结构组分之一,哺乳类细胞的核纤层蛋白(lamin)成分可分成3种:lamin A,lamin B,lamin C.核纤层与核膜、染色质及核膜孔复合体在结构上有密切联系.可能具有支持核膜,为间期染色质提供锚定位点的功能.淋巴细胞核纤层的成分尚有争议,Rober等报道没有发现lamin A/C;而Guilly等的结果显示在淋巴细胞(T和B)分化的早期(包括淋巴母细胞,胸腺淋巴细胞)

LITAF、RAB7、LMNA和MTMR2基因在中国人腓骨肌萎缩症患者的突变分析

为了分析LITAF、RAB7、LMNA和MTMR2基因在中国人腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)的突变特点,文章分别应用PCR结合DNA序列分析方法和PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)结合DNA序列分析方法对6个常染色体显性遗传家系先证者和27个散发病例进行LITAF和RAB7基因突变分析;应用PCR-SSCP结合DNA序列分析方法对14个常染色体遗传的CMT家系先证者和27个散发患者进行LMNA和MTMR2基因突变分析。结果发现:LITAF基因c.269G→A、c.274A→G序列变异和LMNA基因c.1243G→A、c.1910C→T序列变异,未发现RAB7和MTMR2基因的序列变异。其中LITAF基因c.269G→A、LMNA基因c.1243G→A和c.1910C→T为新发现的单核苷酸多态;LITAF基因c.274A→G为已知多态。说明LITAF、RAB7、LMNA和MTMR2基因突变在中国人CMT患者中罕见。

靶蛋白Ezrin和Lamin A/C与卵巢癌的表达及意义相关研究

目的探讨并分析埃滋蛋白(Ezrin)和核纤层蛋白A/C抗体(Lamin A/C)在卵巢癌组织中的表达变化及其与患者临床病理特征的关系。方法选取2011年5月—2016年5月在湖北中医药大学黄家湖医院病理科收集的30例正常卵巢组织标本(正常组)、手术后切除经病理学证实的卵巢癌标本65例(卵巢癌组)及卵巢良性肿瘤组织40例(良性组),采用免疫组织化法检测3组标本中的Ezrin和Lamin A/C蛋白的表达情况,并分析其与患者的临床病理特征的关系。结果正常组、良性组的卵巢组织标本中Ezrin和Lamin A/C蛋白表达阳性率分别为93.33%、87.50%、93.33%、90.00%,显著高于卵巢癌组的49.23%、52.31%,差异均有统计学意义(P<0.05);卵巢组织标本中Ⅰ+Ⅱ期、高+中分化、未发生淋巴结转移的患者Ezrin和Lamin A/C蛋白表达阳性率显著高于Ⅲ+Ⅳ期、低分化、发生淋巴结转移的卵巢癌患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 Ezrin和Lamin A/C蛋白的表达与卵巢癌转移密切相关,Ezrin和Lamin A/C蛋白在卵巢癌组织中表达下调,并且与患者的临床病理特征具有一定的关系,同时提示了Lamin A/C以及Ezrin可以作为潜在的卵巢癌患者病情评估以及临床预后的指标。

地西他滨逆转肺腺癌厄洛替尼耐药的作用及机制

目的探讨地西他滨逆转人肺腺癌HCC827/ER细胞厄洛替尼耐药的作用及机制。方法地西他滨、厄洛替尼或联合用药处理HCC827/ER细胞株,MTT法、BrdU、克隆形成实验检测细胞增殖;细胞划痕和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;Western blot检测细胞周期相关蛋白表达;DNA甲基化检测laminA/C启动子区甲基化水平。结果地西他滨联合厄洛替尼可明显抑制HCC827/ER细胞增殖,迁移和侵袭能力;抑制laminA/C基因启动子区甲基化水平,促进laminA/C蛋白表达;抑制细胞周期相关蛋白CyclinA2、CyclinB1、CyclinD1、CDK4、CDK6表达,促进p21蛋白上调,阻滞细胞周期。结论地西他滨通过促进laminA/C表达、细胞周期阻滞诱导耐药细胞死亡,逆转肺腺癌HCC827/ER细胞对厄洛替尼的耐药。

BLM解旋酶与LMNA蛋白相互作用的鉴定及验证

布卢姆(Bloom,BLM)解旋酶是一种多功能蛋白,其与多种蛋白共同参与前列腺癌的发生发展过程,因此对该蛋白研究有助于解析其在前列腺癌发生和发展等过程中的作用机制。实验以前列腺癌PC3细胞为研究对象,应用免疫共沉淀(Co-IP)联合质谱鉴定和生物信息学分析的方法,鉴定与BLM解旋酶存在相互作用的蛋白,以及其相互作用蛋白与BLM解旋酶在前列腺癌中的相关性,初步筛选确认核纤层蛋白A/C(Lamin A/C,LMNA)具有重要研究价值,并在此基础上进行反向Co-IP和间接免疫荧光试验验证。研究结果证实BLM解旋酶与LMNA存在相互作用。BLM解旋酶与LMNA蛋白互作的确定对研究调控前列腺癌细胞增殖和迁移等奠定了基础。

双氢青蒿素联合顺铂活化Caspase-6、Lamin A/C表达诱导H1299细胞凋亡

目的研究双氢青蒿素(DHA)联合顺铂(Cis)对肺腺癌细胞株H1299的生长抑制作用效果及对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶6(Caspase-6)和核纤层蛋白A/C(Lamin A/C)表达的影响.方法体外培养人类肺腺癌H1299细胞并将细胞分为4组:DHA组、Cis组、DHA联合Cis组及对照组,通过四甲基偶氮唑盐/噻唑蓝实验来评价不同处理对H1299细胞增殖抑制的影响.采用流式细胞术检测以上各组对H1299细胞凋亡率的影响.通过赫斯特33258对细胞核完成染色来观察各组H1299细胞核的形态变化.采用蛋白质印迹法评价凋亡相关蛋白Caspase-6及Lamin A/C的表达情况.结果 DHA联合Cis组对H1299细胞的抑制率高于单药组.DHA联合Cis产生协同抑制H1299细胞的作用.DHA联合Cis对H1299细胞产生促凋亡作用.DHA联合Cis组Caspase-6及Lamin A/C的活性片段的表达均高于单独用药组.结论 DHA联合Cis组对肿瘤细胞的抑制明显高于单药组,并具有协同增强作用,其机制可能与提高了Caspase-6及Lamin A/C活性片段的表达有关.

南京地区汉族人群LMNA基因多态性与代谢综合征的相关性研究

目的探讨核纤层蛋白A/C(nuclear lamin A/C,LMNA)基因第十外显子第1908位点基因多态性与南京地区汉族代谢综合征的相关性。方法代谢综合征(metabolic syndrome,MS)患者56例为MS组,体检健康者52例为对照组,比较2组体质量指数(body mass index,BMI)、血压、血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、三酰甘油(triacylglycerol,TG)、空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)水平;应用柱式DNA抽提法提取全血基因组DNA,采用Taqman-MGB技术对2组LMNA基因第十外显子1908C/T位点的单核苷酸多态性分型进行检测;将56例MS患者依据是否伴有动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块分为2组,比较MS组与对照组,MS组伴和不伴AS者1908C/T基因型及等位基因频率。结果 MS组BMI[(28.10±2.40)kg/m2]、收缩压[(140.20±14.40)mm Hg]、FPG[(6.26±1.90)mmol/L]、TG[(1.97±1.20)mmol/L]水平均高于对照组[(22.10±2.00)kg/m2、(127.80±16.10)mm Hg、(5.21±0.90)mmol/L、(1.26±0.40)mmol/L](P<0.05),TC、LDL-C、HDL-C水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);MS组LMNA1908位点CC基因型频率(45.95%)与对照组(54.05%)比较差异无统计学意义(P>0.05),CT+TT基因型频率(64.71%)高于对照组(35.29%),但差异无统计学意义(P>0.05);MS组LMNA基因1908位点T等位基因频率(68.42%)高于对照组(31.58%)(P<0.05);MS组伴AS者32例,不伴AS者24例,伴AS者LMNA基因1908位点CT+TT基因型频率(54.55%)及T等位基因频率(61.54%)均高于不伴AS者(45.45%,38.46%),但差异无统计学意义(P>0.05)。结论南京地区汉族MS患者发病可能与LMNA基因1908位点T等位基因频率有关。