敲低核纤层蛋白B1通过抑制PI3K/AKT通路在肝癌中发挥抑癌作用

目的探讨核纤层蛋白B1(lamin B1,LMNB1)对肝癌进展的影响,发掘肝癌新的治疗靶点。方法利用工具网站基因表达水平值的交互式分析平台(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)分析癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中肝癌组织及癌旁组织LMNB1的表达水平,使用Kaplan-Meier分析LMNB1表达水平差异对肝癌患者预后的影响。采用实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测正常肝细胞系及肝癌细胞系中LMNB1表达水平。选取LMNB1表达水平较高的两种人肝癌细胞株Hep3B、HepG2,转染小干扰RNA敲低LMNB1表达,在LMNB1表达水平较低的细胞SUN475中构建LMNB1稳定过表达细胞系并使用Western blot验证转染效率,采用CCK8法检测敲低或过表达LMNB1后肝癌细胞的增殖能力,采用平板克隆形成检测敲低或过表达LMNB1后细胞形成克隆的能力。采用Transwell检测敲低或过表达LMNB1后细胞侵袭及迁移能力的变化。采用Western blot实验检测磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases,p-ERK)及细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的变化。结果TCGA数据库分析表明肝癌组织中LMNB1表达水平较癌旁正常组织高(P<0.05),且LMNB1表达水平与肝癌患者预后呈负相关(P=0.003)。实时定量PCR显示相对正常人肝细胞系,肝癌细胞中LMNB1 mRNA表达量分别为MHCC97H:1.80±0.10(t=11.08,P<0.001);SUN475:1.29±0.03(t=5.88,P=0.004);HepG2:2.97±0.04(t=39.68,P<0.001);PLC/Prf/5:1.74±0.04(t=14.51,P<0.001);HuH7:1.70±0.02(t=15.22,P<0.001);SK-HEP-1:1.59±0.05(t=11.17,P<0.001);Hep3B:2.27±0.09(t=18.50,P<0.001);均显著高于正常人肝细胞系。Westernblot结果显示在HepG2及Hep3B细胞系中,与siScramble阴性对照组相比,转染siLMNB1实验组的LMNB1表达水平显著降低(HepG2:0.60±0.10 vs 1.60±0.10,t=11.55,P<0.001;Hep3B:0.40±0.10 vs 1.70±0.10;t=15.61,P<0.001);而SUN475中转染质粒后LMNB1表达显著增加(0.70±0.20 vs 0.07±0.04;t=5.541,P=0.005)。敲低LMNB1后培养96 h,与对照组相比,Hep3B(10.81±0.67 vs 15.48±0.62;t=8.86,P<0.001)及HepG2(9.45±0.61 vs17.08±0.75;t=13.67,P<0.001)细胞增殖能力被显著抑制;而在SUN475中过表达LMNB1后,实验组细胞增殖活性显著增加(16.94±1.52 vs 12.65±1.06;t=3.99,P=0.016)。在HepG2及Hep3B细胞系中敲低LMNB1后,细胞克隆形成数显著减少[HepG2:(90.30±7.24)个vs(382.01±25.27)个,t=19.24,P<0.001;Hep3B:(128.03±8.24)个vs(395.85±28.27)个,t=15.76,P<0.001],在SUN475中过表达LMNB1组比对照组克隆形成个数显著增加[(467.82±42.45)个vs(85.31±15.32)个;t=14.87,P=0.001]。在HepG2及Hep3B细胞系中敲低LMNB1后,肝癌细胞迁移数量显著减少[HepG2:(75.25±8.10)个vs(15.02±3.50)个,t=11.90,P<0.001;Hep3B:(168.20±12.26)个vs(34.83±7.61)个,t=15.96,P<0.001],侵袭的细胞数量同样显著减少[HepG2:(110.21±12.01)个vs(25.76±4.03)个,t=11.50,P<0.001;Hep3B:(150.22±15.16)个vs(22.03±14.26)个,t=10.65,P<0.001];在SUN475中,过表达LMNB1组比对照组细胞迁移数量显著增加[(50.11±5.55)个vs(349.85±25.26)个;t=11.33,P<0.001],侵袭的细胞数量同样显著增加[(40.11±5.26)个vs(80.13±12.20)个;t=5.21,P=0.007]。与对照组相比,敲低LMNB1后,AKT的磷酸化活性形式p-AKT表达水平显著下降,而过表达LMNB1可导致p-AKT表达升高(P均<0.05)。而敲低或过表达LMNB1后,p-ERK表达水平无显著变化,AKT和ERK的本底表达水平均未发生明显变化。结论抑制LMNB1可通过抑制PI3K/AKT信号转导通路的激活抑制肝癌的发生发展,可作为诊断肝癌的生物标记物和潜在的治疗靶点。

慢病毒转染人角质形成细胞高表达核纤层蛋白B1

目的通过对慢病毒载体稳定转染人角质形成细胞(HaCaT)株和未转染HaCaT细胞进行比较蛋白组学分析,找出其差异表达蛋白,寻找基因修饰组织工程表皮种子细胞生长特性改变的原因和可能存在的成瘤性安全隐患。方法选择慢病毒载体稳定转染后生长特性发生明显改变的转染株细胞,采用二维电泳技术对该转染株和未转染株的总蛋白进行分离和比较,找出差异表达蛋白点,再进行串联质谱鉴定。从鉴定得到的差异蛋白中选择可能与细胞生长特性改变和肿瘤生成相关的核纤层蛋白B1(lamin B1)采用Western blot和实时荧光定量PCR技术(qPCR)对其表达差异进行验证。结果与未转染株比较,转染株在二维电泳中存在11个差异表达蛋白点,质谱从其中鉴定出7个蛋白质。选取其中与细胞增殖和凋亡相关的核纤层蛋白B1通过WB和qPCR证实其在转染株中蛋白和转录水平均存在明显的高表达。结论慢病毒载体稳定转染株HaCaT细胞株相对未转染株核纤层蛋白B1高表达。这种高表达可能与转染株细胞生长特性改变和潜在的成瘤性隐患相关。

核纤层蛋白B1通过影响端粒酶活性调控肝癌细胞生长

核纤层蛋白B1(nuclear lamina protein B1,LMNB1)高表达于肝癌组织中,通过敲低LMNB1探讨其对肝癌细胞增殖的影响及其机制。利用siRNA在肝癌细胞中敲低LMNB1,Western blotting检测敲低效果,使用端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol assay,TRAP)检测其端粒酶活性变化。利用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测其端粒长度变化。并通过CCK-8、克隆形成、Transwell、划痕实验检测其生长,侵袭和迁移能力变化。利用慢病毒系统构建稳定敲低LMNB1的HepG2细胞,检测其端粒长度及端粒酶活性变化,采用SA-β-gal衰老染色检测细胞衰老情况,通过裸鼠皮下成瘤实验及对肿瘤后续的组化染色,SA-β-gal衰老染色,端粒荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测其对成瘤性的影响。最后利用生物信息分析的方法寻找LMNB1在临床肝癌组织中的表达情况,及其与临床分期、病人生存期的关系。HepG2和Hep3B中敲低LMNB1后端粒酶活性显著降低,细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低,细胞和裸鼠成瘤实验证明稳定敲低LMNB1后端粒酶活性降低的同时端粒长度缩短,细胞发生衰老,此外细胞成瘤性降低,Ki-67表达降低,生物信息分析结果显示,LMNB1高表达于肝癌组织,且与肿瘤分期和患者生存相关。LMNB1在肝癌细胞中过表达,其有望成为评估肝癌患者临床预后的指标和精准治疗的靶点。

核纤层蛋白B1的功能及其在神经系统疾病和肿瘤中的研究新进展

核纤层蛋白B1 (Lamin B1)是核纤层蛋白家族重要成员之一,其主要功能在于维持细胞核骨架完整性,并通过影响染色体分布、基因表达及DNA损伤修复等参与细胞的增殖和衰老。其表达异常与多种疾病有关,如神经系统疾病(神经管畸形,ADLD)及肿瘤(胰腺癌)等,是潜在的药物靶点和肿瘤标志物。对Lamin B1功能的深入研究,将有助于对相关神经系统疾病和肿瘤发生发展的分子机制的了解并为治疗靶点研究提供新方向。

LaminB1蛋白在食管鳞癌组织中表达的形态学观察

目的探讨laminB1蛋白在食管鳞癌患者的癌组织及上切缘正常粘膜上皮中表达的形态变化。方法制备组织切片原位核基质,应用免疫组化的方法检测核基质制备前后正常粘膜上皮及癌组织中laminB1的表达;同时提取组织核基质蛋白,应用Westen blot检测核基质蛋白中laminB1的表达。结果正常食管粘膜上皮及食管鳞癌组织核基质制备前后laiminB1表达的阳性率分别为:正常粘膜上皮93.3%、正常粘膜上皮核基质86.7%、癌组织96.7%、癌核基质86.7%。正常粘膜上皮laminB1表达阳性细胞从基底层至颗粒层逐渐减少,制备核基质后正常粘膜上皮核基质laminB1表达阳性细胞数目减少、强度明显减弱,阳性细胞集中于基底层,多数细胞整个胞核着色。癌组织laminB1表达阳性细胞散在分布,无规律;癌核基质laminB1表达阳性强度减弱,阳性颗粒在核周较集中。癌核基质laminB1表达的阳性强度比正常粘膜上皮核基质高,差异有显著性(x2=5.042,P<0.05)。Western blot检测显示正常粘膜核基质的laminB1条带比癌核基质弱。结论laminB1蛋白在食管正常粘膜上皮及食管鳞癌组织中广泛存在。制备核基质后,laminB1蛋白在癌核基质的表达比正常粘膜上皮核基质强;且癌核基质中laminB1的分布与正常粘膜上皮核基质存在差异。

苯丙胺致大鼠黑质多巴胺神经元损伤与LaminB1和GRP94的关系

目的探讨苯丙胺对黑质DA神经元损伤的机制。方法将60只大鼠随机分为3组:空白组10只、生理盐水组10只、苯丙胺处理组40只。苯丙胺处理组又随机分为苯丙胺给药(剂量为2.5 mg·kg-1·d-1)后1 h、1 d、7 d和14 d组,每组各10只。观察给药后的行为学变化,再用Western blot方法检测各组黑质LaminB1和GRP94蛋白的表达量。结果苯丙胺在首次给药后就可引起大鼠自主活动量的增加,并且随着给药时间的延长出现了刻板行为;Western blot方法检测黑质GRP94和LaminB1蛋白的表达在各组间未见差异。结论低剂量短时间苯丙胺对黑质DA能神经元的损害可能与GRP94和LaminB1蛋白的变化没有关系。

常染色体显性遗传成人型脑白质营养不良一例并文献分析

目的 报道1例常染色体显性遗传成人型脑白质营养不良（ADLD）患者的临床表现、遗传特征、影像学特点及基因检测结果，以有助于临床诊断。方法报道国内首例ADLD患者诊疗经过。结合辅助检查结果及相关文献复习，分析ADLD特点。结果本例患者为中年男性，以便秘、勃起障碍为主要表现，隐袭起病，呈缓慢进展性病程。MRI提示双侧大脑半球及桥臂为著的对称性脑白质病变，基因检测发现编码核纤维层蛋白B1的LMNB1基因1—11号外显子重复变异。家族中数人有类似临床症状。结论自主神经症状合并对称性脑白质病变时，需考虑LMNB1基因相关的ADLD可能。

常染色体显性遗传成人型脑白质营养不良一家系研究

目的对常染色体显性遗传成人型脑白质营养不良(ADLD)一家系的临床资料和基因突变进行分析。方法回顾性分析河南省人民医院神经内科2020年1月收治的常染色体显性遗传ADLD一家系共4代人(其中5例患者)的临床和影像学资料,对先证者及部分家系内成员的外周血基因组DNA进行全外显子测序分析。采用荧光定量PCR验证先证者及家系内成员的致病基因。结果先证者及家系中其他患者的临床表现包括自主神经功能障碍(一过性低血糖及瞳孔散大)、慢性痉挛性截瘫、运动障碍等,神经影像学特征为广泛脑白质、小脑脚、胼胝体及脊髓受累。全外显子测序分析显示先证者核纤层蛋白B1(LMNB1)基因1~11外显子单倍重复。荧光定量PCR检测结果证实先证者及2个妹妹LMNB1基因1、5、11外显子单倍重复。结论LMNB1基因1~11外显子单倍重复可导致ADLD,诊断该病时应综合分析临床表现、神经影像和遗传学特征。