牛磺酸对次氯酸诱导的大鼠肝细胞核核苷三磷酸酶损伤的保护作用

目的 探讨牛磺酸对次氯酸 (hypochlorousacid ,HOCl)诱导的大鼠肝细胞核核苷三磷酸酶 (NTPase)损伤的保护作用。方法 体外分离大鼠肝细胞核 ,用HOCl单独或与牛磺酸共同孵育 ,分别以ATP和GTP作底物检测核NTPase的活性。结果 ATP和GTP作底物时 ,HOCl(1× 10 - 9～ 5× 10 - 6 mol·L- 1 )以浓度依赖的方式抑制NTPase活性。牛磺酸 (1× 10 - 6 ～ 1× 10 - 4mol·L- 1 )可显著拮抗HOCl(1× 10 - 6 mol·L- 1 )导致的NTPase活性降低。另外 ,牛磺酸 (1×10 - 6 ～ 1× 10 - 4mol·L- 1 )单独孵育肝细胞核 ,对NTPase有轻度刺激作用。结论 牛磺酸可浓度依赖地拮抗HOCl诱导的肝细胞核NTPase活性下降 ,此作用可能是其保护机制之一。

金属硫蛋白对羟自由基损伤的大鼠肝细胞核核苷三磷酸酶的保护作用

目的 :研究金属硫蛋白 (MTs)是否对羟自由基 (hydroxylradical,·OH-)损伤的大鼠肝细胞核核苷三磷酸酶 (NTPase)具有保护作用。方法 :以羟自由基发生系统Fe3 +/H2 O2 单独或与MTs共同孵育大鼠离体肝细胞核 ,检测分别用ATP和GTP作底物时大鼠肝细胞核NTPase活性。结果 :不同浓度Fe3 +/H2 O2 ( μmol·L-1/ μmol·L-1:0 1/0 5、0 5 / 2 5、1/ 5、5 / 2 5 )孵育肝细胞核 ,浓度依赖地增强核NTPase活性 ,与对照组差异显著 (P <0 0 1)。用不同浓度的MT( 10 -9- 10 -4mol·L-1)与Fe2 +/H2 O2 ( 1μmol·L-1/ 5 μmol·L-1)共孵育 ,浓度依赖地拮抗Fe3 +/H2 O2 诱导的效应 (P<0 0 1)。用MT单独孵育肝细胞核对NTPase的活性没有影响 (P >0 0 5 )。结论 :Fe3 +/H2 O2 系统产生的·OH对核NTPase活性具有强烈的抑制效应 ,MT浓度依赖地拮抗·OH导致的NTPase活性降低。

双抗夹心ELISA法检测弓形虫核苷三磷酸脱氢酶-Ⅱ型蛋白的研究

目的建立双抗夹心ELISA法检测弓形虫核苷三磷酸脱氢酶-Ⅱ型(NTPase-Ⅱ)蛋白。方法用重组弓形虫NTPase-Ⅱ(rTgNTPase-Ⅱ)蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选高滴度、高特异性的单克隆抗体建立双抗夹心ELISA法。通过检测弓形虫速殖子全虫蛋白与rTgNTPase-Ⅱ的浓度评价该方法的敏感性。通过对疟疾(7例)、日本血吸虫病(12例)、并殖吸虫病(14例)和脑囊尾蚴病(10例)患者血清进行交叉反应试验,评价该方法的特异性。结果获得2株稳定分泌抗rTgNTPase-Ⅱ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为MNT1和MNT2。蛋白质印迹分析(Westernblotting)显示,2株单克隆抗体均能特异性识别弓形虫rTgNTPase-Ⅱ蛋白和弓形虫速殖子全虫蛋白。以MNT1为包被抗体,MNT2为酶标抗体,建立的双抗夹心ELISA可检测出全虫蛋白的最低浓度为6μg/ml,检测出rTgNTPase-Ⅱ的最低浓度为1.5μg/ml。该方法的特异性为100%。结论以抗rTgNTPase-Ⅱ蛋白单克隆抗体MNT1与MNT2为基础建立的双抗夹心ELISA法具有较高的特异性。

内皮素1和血管紧张素Ⅱ对大鼠肝细胞核核苷三磷酸酶活性的影响

核被膜核苷三磷酸酶 (nucleosidetriphosphatase ,NTPase)为通过细胞核孔复合体转运mRNA的限速酶。本实验探讨内皮素 1(ET 1)和血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对大鼠肝细胞核NTPase活性的影响。体外分离的大鼠肝细胞核与ET 1或AngⅡ单独或分别与ET 1的ETA受体拮抗剂JKC30 1、ETB受体拮抗剂BQ788或AngⅡ的AT1受体拮抗剂Losartan、AT2 拮抗剂PD12 3177共同孵育肝细胞核 ,分别测定ATP和GTP作底物时 ,肝细胞核NTPase活性。结果发现ATP和GTP作底物时 ,ET 1(10 -11～ 10 -9mol/L)或AngⅡ (10 -11～ 10 -9mol/L)孵育肝细胞核均浓度依赖地增强其NTPase活性 (均P <0 0 1) ,ET 1和AngⅡ对NTPase的刺激作用可分别被JKC30 1(10 -6mol/L)和Losartan (10 -6mol/L)阻断 (P <0 0 1)。ET 1和AngⅡ共同孵育后 ,核NTPase活性与ET 1或AngⅡ单独孵育相比显著增加 (均P<0 0 1)。结果表明 :ET

核被膜核苷三磷酸酶

核被膜上的核苷三磷酸酶通过提供能量以促进细胞核内成熟mRNA从核内向胞装进行转移，这一转运过程是制约细胞成熟mRNA能否表达出蛋白质的一重要环节，现已经知道调节该酶活性的因素除成熟mRNA的polyA结构上，还有很多其它的因素。

鸟嘌呤核苷三磷酸分析方法研究进展

鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)在许多生命体的生命活动中起着很重要的作用,它不仅是一种能量供给体,辅助三磷酸腺苷(ATP)供给生命体所需能量,还参与生命体内许多酶的催化活化。本文综述了GTP的一些相关分离技术,并重点介绍了GTP最终检测的方法。

利用固定化啤酒酵母合成5’-核苷三磷酸

固定化啤酒酵母细胞由5’-核苷一磷酸(NMPs)合成5’-核苷三磷酸(NTPs)。在250mL摇瓶中加入20g固定化酵母细胞和20mL反应液(NMP 40mmol/L,葡萄糖150mmol/L,K2HPO4-KH2PO4缓冲液250 mmol/L,硫酸镁10mmol/L),pH 7.0,35℃,反应2.5h,NTP转化率达到80%。底物溶液添加NAD+后,该固定化酵母细胞可反复使用10次,NTP的转化率稳定维持在70%以上。

凝血酶受体激活肽对豚鼠心室肌细胞腺嘌呤核苷三磷酸敏感性钾通道的作用

目的：研究凝血酶受体激活肽（TRAP）对豚鼠心室肌细胞腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）敏感性钾（K。）通道的作用及在保护心肌细胞方面的作用。方法：对健康成年豚鼠采取心室肌细胞急性分离，采用单通道膜片钳记录技术中的细胞贴附式及内面向外模式记录吡那地尔（Pinacidil）、ATP、格列苯脲（Glibenclamide）、TRAP对豚鼠单个心室肌细胞K。通道电流的影响。结果：加入吡那地尔后Km通道的通道活动度（0．55±0．07）比加药之前（0．23±0．05）±曾加（记录5次）；在吡那地尔存在时，加入ATP后KATP通道的通道活动度（0．67±0．14）较加入ATP之前（0．10±0．05）减少（记录4次）；加入格列苯脲后K椰通道的通道活动度（0．56±0．12）比加药前（0．06±0．03减少（记录5次）；加入TRAP后通道的通道活动度（0．48±0．11）比加入TRAP前（0．15±0．11）增加（记录5次），上述比较差异均有统计学意义（P〈0．05～0．01）。结论：TRAP激活心室肌细胞K。通道，对心肌细胞具有保护作用。

决明子、黄芪对大鼠棕色脂肪组织线粒体内膜解偶联蛋白与鸟嘌呤核苷三磷酸结合的影响

目的:探讨决明子、黄芪对大鼠棕色脂肪线粒体内膜解偶联蛋白(UCP)活性与含量的影响。方法:用~3H 标记的鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)与 UCP 相结合,用液体闪烁仪测定其放射性活性,经 ScatchardPlot 分析得出两者结合的解离常数(Kd)和最大结合量(Bmax)。结果:决明子组 Bmax、Kd 值与对照组比较无显著性差异;黄芪组较对照组 Bmax 增加1.29倍,Kd 值无改变。结论:决明子对棕色脂肪线粒体内膜 UCP含量增加及活性无明显影响;黄芪能使棕色脂肪线粒体内膜 UCP 含量增加,但不能使其活性增加。

弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ(NTPase-Ⅱ)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-NTPase-Ⅱ并在COS-7细胞中进行瞬时表达。方法以pBAD-HisB-NTPase-Ⅱ质粒为模板,PCR扩增NTPase-Ⅱ目的基因,将其克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,双酶切及测序鉴定重组质粒。阳离子脂质体法转染COS-7细胞并经SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白的表达。结果经鉴定,弓形虫pcDNA3.1(+)-NTPase-Ⅱ核酸疫苗质粒构建成功。以脂质体法转染COS-7细胞后,转染细胞可成功地表达弓形虫NTPase-Ⅱ蛋白。结论证实了弓形虫NTPase-Ⅱ蛋白能在真核细胞中表达,为该基因的核酸疫苗研究提供了实验依据。

以杆菌肽为模板的金簇制备及其在腺嘌呤核苷三磷酸检测中的应用

建立了一种以杆菌肽(Bacitracin)为还原剂和模板制备金纳米簇的方法,并利用腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)能恢复Fe^(3+)淬灭的金纳米簇荧光的特性,设计了一种"点亮"型金纳米簇荧光探针,用于ATP的检测。在pH=1的水溶液中,Bacitracin与HAuCl_4的摩尔比为1∶1时,室温下反应2 h,成功制备了有较强荧光的金纳米簇AuNCs@Bacitracin。淬灭剂Fe^(3+)浓度为5 mmol/L时,对AuNCs@Bacitracin的荧光淬灭程度达98%。基于AuNCs@Bacitracin-Fe^(3+)复合物建立了一种检测ATP的方法,ATP浓度为10μmol/L～8 mmol/L范围内时,lg(F/F0)与浓度呈线性关系,R^2=0.9902。利用此方法对加标人工血清样品进行检测,3个加标水平下ATP的回收率为103.0%～105.0%,RSD<1.0%,结果准确可靠。

焦磷酸钠对腺嘌呤核苷三磷酸解离氧化肌动球蛋白的影响

研究焦磷酸钠(sodium pyrophosphate,TSPP)对肌动球蛋白的氧化和解离程度,及对腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)解离氧化肌动球蛋白效果的影响。结果表明,TSPP处理能抑制蛋白适度氧化(1 mmol/L H2O2),但氧化程度加深(10、20 mmol/L H2O2)时抑制不明显。TSPP和ATP分别处理时,未氧化肌动球蛋白的特性黏数分别下降了30.4%和41.9%,平均粒径分别下降了21.2%和48.4%。二者相继处理后,特性黏数和平均粒径反而上升。所有氧化样品中由ATP引起的相对黏数变化量几乎都稍高于未氧化样品,但TSPP处理使升高幅度减弱。无论是否经过ATP处理,TSPP样品中均存在未解离且呈纤维状的肌动球蛋白,氧化后形成大的聚集物。可见,TSPP解离效果远不及ATP,且能抑制ATP的解离作用,氧化在一定程度上能促进ATP解离,但受TSPP抑制。研究结果为利用TSPP改善肉制品品质提供了理论依据。

基于纳米金的腺嘌呤核苷三磷酸检测体系的研究进展

腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)是机体代谢过程中不可或缺的能量物质,参与机体的各项重要的生理生化活动,在各方面起着至关重要的作用。因此,对ATP的快速精准检测具有重要的临床意义。纳米金(AuNPs)因优良的光学特性、催化活性、生物相容性等特点,被广泛应用于构建ATP检测体系。本文综述了目前AuNPs应用于ATP检测(如比色、荧光分析、电化学、电化学发光、化学发光以及表面增强拉曼散射等)的研究进展,比较了各种检测方法的优点与不足,并对AuNPs在ATP检测应用中面临的挑战和机遇作了展望。

正常细胞及肿瘤细胞内核苷酸库的分析

通过离子对反相高效液相色谱 (IP RPLC)同时检测细胞内的核糖核苷三磷酸及脱氧核糖核苷三磷酸现已成为可能 ,采用这种方法检测了 16种正常及肿瘤细胞内的ADP、CTP、dCTP、GTP、UTP、dGTP、dTTP、ATP、dATP等核苷酸的含量 ,并进行了简要的对比及方法学验证。采用 6 %三氯乙酸分离提取样品 ,并用 5mol l碳酸钾中和后进行HPLC分析。采用Waters 6 0 0E 4 86色谱系统 ,SymmetryC1 8(3 5 μm ,4 6× 15 0mm)分析柱及Nova -PakC1 8SentryGuardColumn进行色谱分析 ,柱温 2 7℃。流动相由两种缓冲液组成 ,采用梯度洗脱 ,流速 1 0ml min。缓冲液A包含 10mmol l氢氧化四丁基胺 ,10mmol lKH2 PO4及 0 2 5 %甲醇 ,并用HCl调pH至 6 9;缓冲液B包括 5 6mmol l氢氧化四丁基胺 ,5 0mmol lKH2 PO4及 30 %甲醇 ,并用NaOH调pH至 7 0。流动相开始时为 6 0 %A及 40 %B ,30min达 40 %A及 6 0 %B ,此比例一直持续到 6 0min。采用各标准品的水溶液作标准曲线 (r均大于 0 99)。各物质测定的精密度 (CV %)平均为日内 0 9%,日间 5 0 %。各物质的检测限 (pmol)分别为 1 39(ADP)、4 32(CTP)、15 5 (dCTP)、2 38(GTP)、4 4 2 (UTP)、9 4 5 (dGTP)、14 6 (dTTP)、2 4 4(ATP)、11 8(dATP)。该测定方法的平均回收率亦可达到 99 5 %

亚慢性PM_(2.5)和O_(3)共同暴露对大鼠鼻黏膜ATP总量及ATP酶活性的影响

目的:探讨细颗粒物(fine particle matter,PM_(2.5))和臭氧(ozone,O_(3))亚慢性共同暴露对大鼠鼻黏膜组织腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)总量及ATP酶活性的影响。方法:采用随机数字表法将20只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠均分为对照组和暴露组,每组各10只,分别饲养于常规清洁级环境和本团队既往所搭建的大气污染物暴露系统中,连续暴露208 d。暴露期间,监测暴露系统内PM_(2.5)和O_(3)浓度,采用自测和站点数据相结合的方法对暴露系统内PM_(2.5)和O_(3)进行综合评估。在暴露第208天处死大鼠取心、肝、脾、肾、睾丸等主要器官和鼻黏膜组织,称量各脏器重量并计算脏器系数。利用所收集鼻黏膜组织,使用生物发光法测定ATP总量,使用分光光度法检测Na^(+)-K^(+)-ATP酶和Ca^(2+)-ATP酶活性。使用两独立样本t检验比较各指标组间差异。结果:自第3周开始至暴露结束,暴露组大鼠体质量高于对照组(P<0.05),两组间脏器系数差异无统计学意义。暴露组日均PM_(2.5)浓度为(30.68±19.23)μg/m3,O_(3)最大8 h浓度(O_(3)-8 h)为(82.45±35.81)μg/m3。暴露组大鼠鼻黏膜组织ATP化学发光值(792.4±274.1)IU/L低于对照组(1126.8±218.1)IU/L,鼻黏膜组织Na^(+)-K^(+)-ATP酶活性(1.53±0.85)U/mg低于对照组(4.31±1.60)U/mg(P<0.05)。对照组和暴露组鼻黏膜组织的蛋白含量分别为(302.14±52.51)mg/L和(234.58±53.49)mg/L,Ca^(2+)-ATP酶活性分别为(0.81±0.27)U/mg和(0.99±0.73)U/mg,组间差异均无统计学意义。结论:亚慢性PM_(2.5)和O_(3)共同暴露可能影响大鼠鼻黏膜组织供氧能力。

二参真武汤对心肾阳虚型慢性心力衰竭大鼠心肌能量代谢的影响

目的:探讨二参真武汤对心肾阳虚型慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌能量代谢的影响。方法:60只大鼠随机选取8只设为空白组,剩余52只通过甲状腺切除后给予0.02%阿霉素腹腔注射建立CHF模型,将建模大鼠随机分为模型组、阳性对照组、二参真武汤低剂量组、二参真武汤高剂量组,每组8只,连续灌胃28 d。给药结束后,ELISA法测空白组、模型组血清三碘甲状腺原氨酸(T_(3))、甲状腺素(T_(4))、氨基末端B型利钠肽(NT-proBNP)和各组心肌组织腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)、B型脑钠肽(BNP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、Na^(+)-K^(+)-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶。彩色多普勒心脏超声检测心功能;HE染色法观察心脏病理形态;天狼星染色法观察心肌胶原纤维沉积形态;电镜观察心肌线粒体超微结构。结果:造模后大鼠血清NT-proBNP上升,T_(3)、T_(4)下降(均P<0.01)。与空白组相比,模型组大鼠左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)下降,左室收缩末期内径(LVIDs)、左心室收缩末期容积(LVESV)上升(均P<0.01)。ATP、ADP、Na^(+)-K^(+)-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶下降,BNP、CK-MB上升(均P<0.01)。心肌细胞肿胀,边缘模糊,胶原纤维沉积增多,线粒体数量减少、嵴模糊。与模型组相比,阳性对照组及二参真武汤低剂量组、二参真武汤高剂量组LVEF、LVFS上升、LVIDs、LVESV下降,ATP、ADP、Na^(+)-K^(+)-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶上升,BNP、CK-MB下降(均P<0.01);肿胀心肌细胞减少,胶原纤维沉积面积缩小,心肌线粒体损伤减轻。结论:二参真武汤可有效改善CHF大鼠心肌损伤,对心脏有保护作用,其机制可能是通过调节ATP、ADP改善心肌能量代谢。

天香丹抑制P2X7/NLRP3表达改善动脉粥样硬化的作用机制研究

目的:探讨天香丹对动脉粥样硬化小鼠嘌呤能配体门控离子通道7(P2X7)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)的影响。方法:选取8周龄无特定病原体(SPF)级雄性载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠30只,予以高脂饲料喂养12周,造模成功后随机分为模型组、阿托伐他汀组、天香丹组,每组10只;另选取C57BL/6J小鼠10只予普通饲料喂养,设为空白对照组。酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清白细胞介素(IL)-18、IL-1β、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的水平;免疫组化检测组织中P2X7、NLRP3的表达。结果:ELISA结果显示:与空白对照组相比,模型组IL-18、IL-1β、ATP水平升高(P<0.05);与模型组相比,阿托伐他汀组、天香丹组IL-18、IL-1β、ATP水平降低(P<0.05)。免疫组化结果显示:与空白对照组相比,模型组P2X7、NLRP3表达均明显升高(P<0.05);与模型组相比,阿托伐他汀组、天香丹组P2X7、NLRP3表达均明显降低(P<0.05)。结论:天香丹改善动脉粥样硬化与调节钾稳态抑制炎症小体的激活有关。

发酵乳和乳饮料中乳酸菌活菌数ATP检测方法的开发与应用

乳酸菌活菌数作为发酵乳和乳酸菌饮料的产品质量属性,同时作为国家风险抽检项目,目前的检测方法存在操作烦琐、检测周期长、结果滞后等缺点,无法满足企业产品卖点宣称及质量控制,故针对发酵乳和乳饮料中乳酸菌活菌数的快速检测方法进行开发、研究,旨在提高检测结果准确性、稳定性及缩短检测周期。每种微生物中的腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine Triphosphate,ATP)含量都是基本恒定的,而ATP的相对发光单位(Relative Luminescence Unit,RLU)与ATP含量呈线性关系,通过建立产品中乳酸菌数量与ATP的RLU(相对发光单位)的相关关系开发乳酸菌快速检测方法。通过试验证实该方法与国家标准检测方法具有一致性,能够快速、准确地检测产品中乳酸菌数活菌数,为生产销售流通中的质量监测提供一种快捷方便的方法。

原花青素对LPS/ATP诱导的NLRP3炎症小体激活及NF-κBp65磷酸化的抑制作用

目的:研究原花青素对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)与腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)联合诱导的小鼠小胶质细胞BV2 NOD样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体激活及核因子(nuclear factor,NF)-κBp65磷酸化的抑制作用。方法:以1.0μg/mL LPS、2.5μmol/L ATP诱导BV2细胞炎症损伤模型,用不同浓度原花青素(0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL)干预细胞。采用噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)法检测细胞存活率;比色法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)释放水平;微量酶标法测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力;ELISA法检测白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18的分泌水平;Western blot法检测NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1、pro-caspase-1、p-NF-κBp65、NF-κBp65蛋白表达水平。结果:不同浓度的原花青素对BV2细胞存活率的影响与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,LPS/ATP诱导可增加BV2细胞NO、IL-1β、IL-18水平以及LDH活力(P<0.05),增加NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、p-NF-κBp65蛋白表达水平(P<0.05)。与LPS/ATP组相比,原花青素能降低BV2细胞NO、IL-1β、IL-18水平以及LDH活力(P<0.05);原花青素(1.0、2.5、5.0μg/mL)降低NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1蛋白表达水平(P<0.05);NF-κB抑制剂BAY11-7082(5.0μmol/L)降低NF-κBp65磷酸化及NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1蛋白表达水平(P<0.05)。结论:原花青素可以抑制LPS/ATP诱导的BV2细胞炎症因子分泌及NLRP3炎症小体激活,该作用与原花青素抑制LPS/ATP诱导条件下NF-κBp65磷酸化密切相关。