核苷二磷酸激酶A亚基的纯化、鉴定及其对顺铂抗癌作用的增强

目的 了解核苷二磷酸激酶A亚基 (NDPK A)能否提高顺铂的抗癌效果。方法 利用十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western印迹杂交来监测和鉴定目标蛋白NDPK A ,利用离子交换、亲和层析结合高效液相色谱纯化分离目标蛋白 ;MTT比色法测定药物对细胞生长抑制率的影响。结果 获得NDPK A单体蛋白 ,酶比活为 8mmol·min- 1·g- 1蛋白质 ;细胞生长抑制率显示 ,NDPK A单独处理细胞时未见明显的细胞毒性 ,但与顺铂联合处理却能大大加强后者对鼠肺腺癌细胞LA795和人喉癌细胞Hep 2的细胞毒性。结论 NDPK A与顺铂联用能增强顺铂对体外培养的鼠肺腺癌细胞LA795和人喉癌细胞Hep

芒果核苷二磷酸激酶(NDPK)基因克隆及表达分析

采用3′RACE和RT-PCR技术克隆芒果核苷二磷酸激酶基因全长c DNA序列,并用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式。结果表明:Mi NDPK1基因c DNA全长1 019 bp,开放阅读框为447 bp,编码148个氨基酸。Mi NDPK1蛋白定位于细胞质,无信号肽和跨膜区域,具有典型的核苷二磷酸激酶活性结构域和其他磷酸化活性位点;与麻疯树、橡胶树同源性最高为89%,与菠菜同源性最低为82%。Mi NDPK1在芒果各组织中均有表达,以叶片中表达最高,其次是花和果皮;在芒果进入生殖时期的花芽分化期表达量最高,此后在芒果果实发育进程中逐渐降低并趋于平稳。结合病害处理转录组样本中的差异性表达结果,推测芒果Mi NDPK1基因在花芽分化进程、抗病性诱导及免疫应答通路上发挥重要作用。

核苷二磷酸激酶A的异构及其分子机制

对核苷二磷酸激酶A(NDPKA)的异构及其分子机制进行研究.还原和非还原SDSPAGE观察重组人核苷二磷酸激酶A(rhNDPKA)的异构;RPHPLC分析rhNDPKA异构体的反相色谱行为,并测定rhNDPKA异构体的酶活性;多角度激光散射法测定rhNDPKA异构体在溶液中的表观分子量;飞行质谱分析异构体的质量肽谱.结果发现,rhNDPKA在非还原SDSPAGE上表现为4条带,对应于NDPKA的氧化型、还原型、氧化型二聚体和还原型二聚体,其分子量分别为18.1kD、21.3kD、35.2kD和38.3kD.RPHPLC发现,还原型rhNDPKA和氧化型rhNDPKA疏水性有差异.新鲜制备的rhNDPKA在纯水溶液中,经空气氧化后,逐渐由还原型向氧化型过渡,而还原剂或生理盐水可使rhNDPKA稳定于还原型或氧化型.酶活测定结果表明,还原型rhNDPKA比活性为1965±166Umg,氧化型rhNDPKA比活性为974±53Umg.多角度激光散射检测发现,还原型rhNDPKA在溶液中仍可形成六聚体.质量肽谱结果证明,在氧化型rhNDPKA中,C4和C145位巯基形成二硫键,而C109位巯基游离存在.根据本文所确定的NDPKA单体中的二硫键位置,推导出rhNDPKA单体异构体和二聚体异构体的变构原理,这为进一步研究NDPKA的多能性调节机制打下了良好基础.

重组人核苷二磷酸激酶A的理化性质

对重组人核苷二磷酸激酶A(rhNDPK A)进行纯化 ,并对重组产物的理化性质及在溶液中的聚合状态进行鉴定。NDPK A工程菌发酵后的菌体高压匀浆 ,然后微孔过滤、超滤浓缩 ,所得样品经DEAE阴离子交换、CibacronBlue亲和层析、分子筛层析三步纯化后 ,以SDS PAGE和RP HPLC分析纯化产物的纯度 ,RP HPLC测定酶活性。合格制品以基质辅助激光解析飞行时间质谱测定相对分子质量 (MW ) ;Edman降解法测定N末端序列 ;多角度激光散射法测定重组产物在溶液中的表观分子量。结果表明 ,rhNDPK A纯化产物的SDS PAGE纯度为 97 3% ,RP HPLC纯度为 99 2 % ;比活性为 (90 0± 10 0 )u mg ;单体相对分子质量为 170 17,与NDPK A分子量理论值相差 132。测序结果表明 ,rhNDPK AN末端缺失Met残基 ,其理论分子量为 170 17,与飞行质谱测定结果完全一致。表观分子量测定结果表明 ,rhNDPK A在溶液中形成六聚体 ,表观分子量为 10 2kD。上述结果说明 ,NDPK A重组产物具与天然产物相同的自发形成六聚体性质 ,这为NDPK A新药开发和机理研究打下了良好基础。

甘蔗核苷二磷酸激酶(NDPK1)基因克隆及表达分析

采用RT-PCR技术克隆了甘蔗核苷二磷酸激酶基因全长cDNA,并用荧光定量PCR分析该基因的表达情况。结果表明:克隆得到的cDNA片段长度为686 bp,包括1个450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,GenBank登录号为JQ712580。甘蔗与高粱NDPK基因cDNA序列的同源性为96%,氨基酸序列同源性为98%;该基因推导的蛋白分子量大小为16.83 ku,等电点为6.58,疏水性分值在-2.089～2.033;蛋白二级结构中α-螺旋占44.3%,随机卷曲占24.83%,延伸链占20.13%,β-转角只占10.74%。实时荧光定量分析结果表明,随着甘蔗干旱胁迫时间的延长,NDPK1基因表达均呈先升高后降低的趋势,30 h达最大;在处理后的18、30、40 h,PEG与PEG+Si处理的NDPK1基因的表达量有显著差异。

植物核苷二磷酸激酶(NDPKs)研究进展

为了给植物核苷二磷酸激酶NDPKs的进一步研究提供参考,总结了植物核苷二磷酸激酶(NDPKs)的分类、亚细胞定位、功能及其在植物基因工程中的应用。重点分析了NDPKs功能方面研究的最新进展,NDPKs不仅能够作为一种"看家酶",维持细胞NDP和NTP代谢平衡,而且还是一组多功能蛋白,参与植物细胞的生长与分化、光敏色素A、紫外线-B、热击响应及氧化胁迫响应中的信号传导等多种生命活动过程,甚至具有核酸酶活性。最后指出植物NDPKs的研究方向,并展望了其在植物抗逆基因工程方面良好的应用前景。

尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸激酶的克隆、表达及纯化

根据GenBank中NDP kinase的基因序列,采用生物信息学方法将其中稀有密码子改造为大肠埃希菌常用密码子并进行二级结构优化,合成NDP kinase基因,构建原核表达载体pET28a-NDP kinase并酶切鉴定其序列,在大肠埃希菌BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,重组产物采用镍离子金属螯合亲和层析柱纯化.经密码子改造和二级结构优化后NDP kinase基因长度为490 bp,其编码蛋白理论分子量为21.5 kDa,重组表达载体经酶切鉴定与理论推测结果相符,在大肠埃希菌BL21(DE3)中该基因经IPTG诱导可高效表达,纯化后的重组蛋白分子量约为21.5 kDa,其单一蛋白纯度达95%以上.本研究成功构建了尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸酶(NDP kinase)基因的pET28a原核重组质粒,为进一步研究NDP kinase在尘螨疫苗免疫治疗中的作用机理提供了基础.

50L规模中试发酵重组核苷二磷酸激酶A工程菌

中试规模发酵重组人核苷二磷酸激酶A（rhNDPK-A）工程菌，并对表达产物进行纯化。摇瓶培养一级种子至合适密度，以10％比例接种二级种子培养基，在7L发酵罐中培养至OD600为9．6～10．5，然后转入80L发酵罐中进行补料分批培养，所得菌体裂解后，经离子交换层析和亲和层析两步纯化得重组蛋白制品。结果表明，50L培养液经过10h培养后，湿菌收量为156％／批，NDPK—A表达量为23．8％。另外，补料方式对发酵密度有明显影响。与单纯补加碳源相比，同时补加碳源和氮源可以显著提高菌体产量，但对目的蛋白表达量的提高不明显。在较优条件下，菌体产量为（2220．00±169．71）g／批，蛋白表达量为（22．00±0．42）％，纯化后重组蛋白得率为510mg／L。产物可溶、密度适中、工艺简便的中试发酵条件的建立为高得率、大规模制备重组rhNDPK—A奠定了基础。

核苷二磷酸激酶A亚基(rhNDPK-A)对体内S_(180)、H_(22)、Lewis及H460肿瘤生长的影响

目的:观察rhNDPK-A对动物移植性肿瘤生长的抑制作用,为临床应用提供科学依据。方法:昆明种健康小鼠85只,每只动物右前肢腋皮下接种传代后8d的S180或H22瘤细胞5×106个,随机分为8组;C57BL/6健康小鼠85只,每只动物右前肢腋皮下接种传代后10d的Lewis瘤细胞2×105个,分组方法同上。给动物接种瘤细胞后24h开始给药。S180和H22模型用尾静脉注射,每日1次,连用8d;Lewis模型用腹腔注射,每日1次,连用10d。Balb/c/neu裸鼠38只,腋窝皮下接种H460瘤组织块1·5mm×1·5mm×1·5mm,当移植瘤体积生长至100mm×100mm×100mm分5组开始腹腔注射给药,每日1次共17次。每周两次测瘤径,计算相对瘤体积,同时称体重。于末次给药后48h处理各组动物,剖瘤称重,计算瘤重抑制率,并进行统计学处理。结果:rhNDPK-A单用,中剂量与高剂量对S180肿瘤生长较明显,抑制率>40%。3个剂量对H22肿瘤生长均具有不同程度的抑制作用,但rhNDPK-A单用,对Lewis肿瘤生长无明显的抑制作用。rhNDPK-A20mg/kg与DDP(0·5mg/kg)合用,对H22肿瘤生长抑制率明显提高。20mg/kgrhNDPK-A对人肺腺癌H460裸鼠移植性肿瘤生长抑制达35·9%。结论:rhNDPK-A对S180、H22、H460肿瘤的生长具有一定的抑制作用,对Lewis肿瘤生长无明显的抑制作用。rhNDPK-A高剂量与DDP合用,对H22肿瘤生长的抑制具有协同作用。

重组人抑癌相关蛋白核苷二磷酸激酶A的原核表达

目的 :为提高表达量 ,简化纯化工艺 ,获得可用于临床研究的重组人NDPK -A蛋白 ,构建带有 6×His纯化标签的原核表达载体 ,优化表达条件获得产物高表达并鉴定产物活性。方法 :将抑癌基因nm2 3-H1从质粒pBVNMH1中亚克隆于带有纯化标签的表达载体pQE4 0中 ;梯度变化表达条件获得产物高表达 ;镍离子螯合层析柱纯化目的蛋白 ;Westernblot鉴定产物的免疫原性 ;HPLC测定产物的激酶活性 ;鸡胚尿囊膜试验鉴定产物抑制血管新生的生物活性。结果 :pQE - 4 0中亚克隆的nm2 3-H1序列无误 ;目的蛋白最高表达量可达 4 9 6 % ;纯化的表达产物能与天然NDPK -A的多克隆抗体特异结合 ;酶比活为 4 72U/mg ;具有抑制鸡胚尿囊膜血管新生的活性。结论 :表达质粒pQE -nm2 3H1能高效表达重组人NDPK -A ,纯化工艺简便 ,产物活性与天然NDPK -A无异。

人重组核苷二磷酸激酶α亚基对MCF-7/S的影响

软琼脂集落形成实验检测rhNDPK -α对乳腺癌细胞株MCF - 7 S集落形成率的影响 ,结果表明 ,MCF - 7 S集落形成率随rhNDPK -α浓度增高下降 ,提示rhNDPK -α可能具有抑制乳腺癌细胞株MCF - 7 S转移作用 ;MTT法检测rhNDPK -α分别联用丝裂霉素C、5 -氟尿嘧啶和千金藤碱对MCF - 7 S的增殖影响 ,结果显示 ,rhNDPK -α分别联用三种化疗物与这三种化疗药物单独作用于MCF - 7 S无明显差异 (P >0 0 5 ) ,提示rhNDPK -α对丝裂霉素C、5 -氟尿嘧啶和千金藤碱没有增敏作用。

海洋聚磷菌中核苷二磷酸激酶基因的克隆及序列分析

以海洋聚磷茵 Halomonas YSR-3的总 DNA 为模板,用 PCR 法扩增核苷二磷酸激酶基因,将扩增片段克隆到 pGM-T 载体,转化 Escherichia coli TOP10菌株,经蓝白斑筛选、菌落 PCR 得到阳性克隆,测序后对序列进行 Blast 比对分析。得到的基因序列长度为420 bp,翻译后的序列与 Loktanella yestfoldensisSKA53,Jannaschia sp.CCS1,Roseobacter sp.CCS2的核苷二磷酸激酶蛋白序列相似性分别为89%,86%,85%。

胃癌组织中nm23的表达及其亚细胞组分中核苷二磷酸激酶活力的比较研究

［ 目的］ 揭示胃癌组织及相应癌旁正常组织中ｎｍ２３ 的表达及其与核苷二磷酸激酶活力的相关关系．［ 方法］ 参考了Ｍａｒｉａ Ｋｅｚｄｉ 所报道的核苷二磷酸激酶活性测定方法，应用尹宗柱等所报道的亚细胞结构分离方法分离并测定了２０ 例胃癌组织（ 转移３ 例，未转移１７ 例） 及其对应癌旁正常组织中组织匀浆液、线粒体、微粒体及细胞胞浆中核苷二磷酸激酶的酶活力，同时应用免疫组织化学法观察了ｎｍ２３ 表达阳性率．［ 结果］２０ 例胃癌原发灶中ｎｍ２３ 阳性表达率为４０ ％ ，２０ 例癌旁正常组织中阳性表达率为１０ ％ ，经卡方检验表明二者有显著性差异．胃癌组织匀浆液及胞浆中核苷二磷酸激酶活力（ 每克组织）与比活力（２６５－９９ ±８４－８１ｍ Ｕ，２－７０ ±０－９５ｍ Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ） ；（２９０－８１±８８－１８ｍ Ｕ，３－５７ ±１－１０ｍ Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ） 均显著高于相应癌旁正常组织的酶活力及比活力（１８１－２８±６３－６１ ，２２９－５７ ±６４－６７ｍ Ｕ；１－７５ ±０－６１ ，２－７４ ±０－７５ｍ Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ） ；两组线粒体酶活力及比活力无显著性差异；而在微粒体中癌旁正常组织核苷二磷酸激酶活力及比活力（８?

中试规模高效纯化重组人核苷二磷酸激酶A

中试规模纯化重组人核苷二磷酸激酶A(rhNDPK-A)。菌体高压匀浆,然后微滤去除菌体碎片,超滤浓缩,所得样品上样DEAE-sepharose Fast Flow,收集目的峰,上样Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B,含ATP的缓冲液洗脱目的蛋白,超滤精制。结果表明,1500g菌体经过2次匀浆后,所得匀浆液中含NDPK47.6g,经过微滤超滤处理后,可回收目的蛋白27.3g。再经过两步柱层析及超滤精制后,最终可得纯度为96.3%的目的蛋白17.2g,总回收率为36.2%,每100g湿菌体的蛋白产率为1.15g。比较每个步骤的回收率,发现精制>亲和层析>离子交换层析>样品前处理过程。与前期报道发酵工艺联用,rhNDPK-A的纯化产量达到510mg/L。工艺简便、得率高的rhNDPK-A纯化工艺的建立为NDPK的应用开发提供了物质基础;另外,本文结果也提示,对于非分泌型重组蛋白来说,影响目的蛋白回收的最主要因素可能不是柱层析,而是样品前处理过程。

过表达核苷二磷酸激酶对透明质酸的产量和相对分子质量的影响

为了考察核苷二磷酸激酶(NDK)对透明质酸合成过程的影响,将核苷二磷酸激酶基因(ndk)和透明质酸合成酶基因在重组枯草芽孢杆菌细胞内共同进行过表达,成功构建了两株工程菌株Hp8tg及Pn8tg,均获得了均一相对分子质量透明质酸(HA)。通过响应面分析试验对诱导条件进行了优化,通过单糖组成分析、傅里叶红外光谱分析及核磁共振波谱分析对HA进行了鉴定。ndk过表达使HA产量提高了1.3倍,相对分子质量提高了1.1倍。研究结果表明,核苷二磷酸激酶的过表达可消除尿苷二磷酸(UDP)蓄积对Ⅱ型透明质酸合成酶的抑制作用,从而提高了HA的产量及相对分子质量。此策略可以有效提高HA的产量和相对分子质量,也为其他多糖的制备提供了新的思路。

核苷二磷酸激酶B稳定表达细胞系的建立及其对新城疫病毒F48E9株复制的影响

为研究核苷二磷酸激酶B(nucleoside diphosphate kinase B,NDPK B)蛋白表达对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F48E9株复制与增殖的影响,本试验将真核表达重组质粒pEGFP-NDPK B转染Vero细胞,经G418压力筛选出了阳性细胞单克隆,并通过RT-PCR、Western blotting和倒置荧光显微镜观察鉴定了NDPK B mRNA和蛋白质的表达,在细胞系基础上,通过HA-HI、TCID50及实时荧光定量PCR检测NDPK B蛋白对NDV F48E9株复制和增殖的影响。结果表明,试验成功地构建了高表达NDPK B蛋白的Vero/NDPK B细胞系,并在此基础上,通过检测证明了NDPK B能抑制NDV F48E9株在Vero细胞中的复制与增殖,提示以NDPK B为基础有可能设计开发抗NDV的新药物或抗病毒增效剂,对NDV进行预防或治疗。

植物核苷二磷酸激酶研究进展

核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate kinases,NDPKs)是一类高度保守的蛋白,大小一般在70-100 k D,在生物体内大多数以六聚体形式存在,仅在少数原核生物中以四聚体形式存在。NDPK主要参与维持核苷二磷酸和核苷三磷酸的平衡。目前在植物中已发现4种NDPK:NDPKⅠ、NDPKⅡ、NDPKⅢ和NDPKⅣ,相关研究主要集中在前3种。NDPKⅠ与植物生长发育、非生物胁迫、感病应激和激素响应有关;NDPKⅡ参与光合作用和活性氧清除;NDPKⅢ参与能量代谢和细胞程序性死亡;NDPKⅣ仅在拟南芥和水稻基因组中发现,预测定位于内质网,功能未知。除了上述的主要作用外,NDPK在某些植物中还有特殊功能,如参与DNA复制、参与淀粉和纤维素的合成、参与生长素调节和发挥核酶活性等。这些作用机制是否存在物种特异性还有待进一步的研究。对NDPK的系统进化、生物功能的最新进展进行了综述。最后对NDPK的发展趋势进行了展望,有助于将来对NDPK进行更深入和全面的研究。

鲍曼不动杆菌核苷二磷酸激酶的结构和功能研究（英文）

近年来,鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)在医院里越来越受到人们的关注,尤其是在重症监护病房(ICUs).它以强大的多重耐药性(multiresistance)而闻名.核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase,NDK)是一种进化上非常保守的酶,它能催化核苷之间磷酸基团的转移.我们解析了鲍曼不动杆菌NDK野生型和C端氨基酸残基Arg141-Thr142-Arg143(RTR)截短突变体的结构.通过和黄色黏菌(Myxococcus xanthus)NDK的三维结构进行比较,推断鲍曼不动杆菌NDK的催化机制和黄色黏菌类似.通过激酶活性实验和圆二色谱实验,发现鲍曼不动杆菌NDK E28A突变体二级结构发生了改变,从而导致蛋白催化活性降低,说明Glu28是鲍曼不动杆菌NDK结构中非常关键的氨基酸残基.鲍曼不动杆菌NDK C端RTR截短突变体显示出催化活性极大的降低,这可能与C端RTR残基介导的二体间相互作用有关.虽然RTR截短突变体中的Lys33伸向了和野生型中不同的方向,和Val15产生相互作用弥补了一部分因为RTR截短丢失的相互作用,维持了RTR截短突变体和野生型类似的结构.但是,Lys33产生的相互作用依然太弱,不足以维持蛋白在催化的动态过程中整体结构的高效转换.我们解析的鲍曼不动杆菌NDK晶体高分辨率结构将有助于科学家设计针对鲍曼不动杆菌的药物.

拟南芥核苷二磷酸激酶基因家族的生物信息学比较与分析

为研究拟南芥核苷二磷酸激酶家族(AtNDPKs)5个成员之间的差异,对其在蛋白质结构、磷酸化位点、信号肽序列、功能区方面的差异进行了生物信息学的比较分析,并建立了系统进化树。结果显示,5个成员在等电点、吸光值和亲水性方面的差异明显。二级结构中,AtNDPK2的α螺旋比例与其他成员差异显著;在β转角和无规则卷曲方面,AtNDPK1a与AtNDPK3a表现出相反的情况。5个成员各含有1个NDK结构域,但分布位置不同。AtNDPK3a中酪氨酸磷酸化明显增多,AtNDPK1a的磷酸化位点与其他成员差异显著。AtNDPK1和AtNDPK2的信号肽裂解点位于第16和17位氨基酸之间,AtNDPK3和AtNDPK3a的位于第42和43位之间,而AtNDPK1a的位于第24和25位之间。AtNDPK1a的进化地位高于其他成员,AtNDPK3与AtNDPK3a的亲缘关系最近,而AtNDPK1与其他成员的亲缘关系较远。