谷氨酸棒杆菌核苷水解酶的酶学性质研究

核苷水解酶是一类催化核苷生成D-核糖及嘌呤或嘧啶的酶,广泛存在于除哺乳动物以外的生物中。该研究表达并纯化了3个来源于谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的核苷水解酶Cgl1364、Cgl1977和Cgl2835并考察其酶学特性。酶学实验结果表明,重组Cgl1364、Cgl1977和Cgl2835均具有核苷水解酶活性;能够催化腺苷、胞苷、鸟苷、黄苷、肌苷和尿苷生成D-核糖和相应的嘌呤或嘧啶,但底物特异性有所差异;重组酶在15~55℃以及pH 4~10条件下均具有活性,其最适温度和pH分别为35℃和7.0;Cgl1977的热稳定性优于Cgl1364和Cgl2835。利用BL-cgl1364静息细胞为酶源催化水解尿苷,底物转化率达到89.5%。该研究首次报道了谷氨酸棒杆菌核苷水解酶的功能和性质,可为D-核糖、嘌呤及嘧啶的“一锅法”生物合成提供重要参考。

肌苷产生菌缺失核苷水解酶活性突变株选育及其发酵生产试验

以枯草芽孢杆菌ＪＳＩＭ－１０１９为出发菌株，经物理、化学诱变剂连续处理，获得一株缺失核苷水解酶活性的突变株ＪＳＩＭ－Ｂ－１９８。该突变株不能降解肌苷，应用于发酵生产中，肌苷产量显著增加。在２０，０００升发酵罐中，连续１０罐批，平均产肌苷１８．３８ｇ／Ｌ，对糖转化率２１．９８％，发酵周期５０ｈ～６０ｈ，该菌株遗传性能稳定，已在工业生产中应用。

肌苷产生菌中降低核苷水解酶的研究

本研究以枯草杆菌肌苷产生菌ＳＤ９４０１（Ａｄｅˉ＋Ｔｈｉˉ＋Ｈｉｓˉ＋８—ＡＧｒ＋６－ＭＰｒ）为出发菌株，经紫外线和硫酸二乙酯诱变，在以肌苷为唯一碳源的补充培养基上筛选到一株核苷水解酶缺失菌株。实验结果表明这一突变株积累比亲株高３０％左右的肌苷，平均达到２６．８９ｍｇ／ｍｌ，最高到２８．０３ｍｇ／ｍｌ。且发酵液中未测出次黄嘌呤。

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因真核表达载体的构建

目的:构建编码弓形虫RH株三磷酸核苷水解酶(NTPase-Ⅱ)重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ。方法:采用PCR从弓形虫基因组DNA中扩增NTPase-Ⅱ基因,克隆入pGEM-T Easy载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定;采用亚克隆将NTPase-Ⅱ基因克隆至真核表达载体PVAX1,筛选阳性重组质粒PVAX1-NTPase-Ⅱ,进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:NTPase-Ⅱ的重组真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,大小为1 887 bp,与预期大小一致;重组真核表达载体的核苷酸序列,与GenBank中的相应序列100%同源。结论:成功构建重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因克隆、表达与鉴定

目的对刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶基因(NTPase)进行克隆、表达和鉴定。方法采用PCR扩增刚地弓形虫RH株的NTPase基因,克隆入pGEM-TEasy载体,经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB,并转入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中进行诱导表达。用镍-次氮基三乙酸亲和层析柱纯化重组质粒pBAD-HisB-NTPase表达产生的含组氨酸的重组蛋白,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析蛋白表达产物。结果PCR扩增得到特异的刚地弓形虫NTPase-Ⅱ基因序列,经测序鉴定无基因突变。SDS-PAGE结果表明NTPase-Ⅱ基因在E.coliBL21(DE3)中获得高效表达,其融合蛋白相对分子质量(Mr)约70000,与理论值相近。Western blotting分析结果显示,纯化的重组蛋白可被弓形虫感染的鼠血清及鼠抗重组蛋白血清识别。结论所克隆表达的弓形虫NTPase-Ⅱ重组蛋白具有良好的抗原性。

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析

目的:克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶(NTPase)的编码基因。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增弓形虫RH株的NTPase基因,克隆入pGEM-TEasy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定,并对获得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果:PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列,测序结果表明,获得的弓形虫NTPase-Ⅱ基因全长1812bp,编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序列同源性为100%。经DNAStar预测NTPase-Ⅱ存在6个潜在抗原表位。结论:成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase-Ⅱ基因,为其相关研究奠定了基础。

刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶的研究进展

刚地弓形虫是一种广泛寄生于人和温血动物的机会致病性原虫，随着在免疫功能低下人群中感染率的逐渐增加，它对人类的危害也日益受到重视。弓形虫三磷酸核苷水解酶（NTPase）是弓形虫利用宿主细胞补救合成嘌呤途径中不可或缺的关键酶。近年来，对NTPase的分子生物学特点和化学特性均有了较深入的研究，该文综述了弓形虫NTPase的定位、分子特性及生理功能等方面的研究进展。

弓形虫三磷酸核苷水解酶-II的克隆、表达及初步应用

目的探讨弓形虫RH株速殖子NTPase-II重组蛋白的免疫反应性及其在抗体检测中的应用。方法通过PCR获得NTPase-II基因,克隆入pGEM-T Easy载体,经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB,构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌中以包涵体形式获得高效表达。SDS-PAGE和Western-blot分析蛋白表达产物。用纯化的表达产物作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步建立检测抗NTPase-II抗体的间接ELISA方法。结果PCR扩增得到特异的弓形虫NT-Pase-II基因序列,经测序鉴定无基因突变。重组质粒诱导表达产物相对分子量约70kD,与理论值相符。经Western-blot证实,重组蛋白可刺激机体产生相应的抗体。具有良好的抗原性和免疫原性。用表达的重组NTPase-II蛋白初步建立了用于NTPase-II抗体检测的间接ELISA方法。结论重组NTPase-II蛋白具有较强免疫原性,可作为诊断抗原用于急性弓形虫感染诊断试剂的研发。

刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶的膜定位及其同工酶的鉴定

刚地弓形虫速殖子具有三磷酸核苷水解酶(NTPase),此酶具有较高的水解活性,能水解ATP、GTP、ADP等。据报道,NTPase存在不同的同工酶,可能与虫株致病性的差异有关。本文首次报道一种单克隆抗体,在体外抑制刚地弓形虫NTPase的活性,并在弓形虫强毒株与弱毒株间,识别区分不同的同工酶。

应用三磷酸核苷水解酶基因检测弓形虫方法的建立

用Primer Explorer V4软件针对弓形虫三磷酸核苷水解酶(NTPase)基因设计了6条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,建立弓形虫LAMP反应体系,并进行特异性和敏感性试验。结果显示,用该反应体系30 min即可检测出弓形虫NTPase基因,产生瀑布状的特异性条带,检测极限为20 copies,敏感性比PCR高10倍。与犬新孢子虫、鹦鹉热衣原体、柔嫩艾美耳球虫、吕氏泰勒虫、羊巴贝斯虫未定种和牛巴贝斯虫间无交叉反应,且重复性良好。应用此方法,可以在攻虫后第2天于试验猪血液中检测出弓形虫,比PCR方法提前2 d。表明将弓形虫NTPase基因作为环介导等温扩增检测弓形虫的目的基因,具有特异性强、敏感性高的特点,是快速诊断弓形虫病的一种新方法。

过表达核苷二磷酸X水解酶21(NUDT21)通过阻断P53/CDK2/Rb通路抑制HCT-116结肠癌细胞的增殖

目的探讨过表达核苷二磷酸X水解酶21(NUDT21)对HCT-116结肠癌细胞增殖的影响及可能的机制。方法Gibson组装法构建NUDT21过表达质粒。克隆形成实验、CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期变化,Western blot法检测P53、细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)的蛋白水平,以及第780位丝氨酸磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白(p-Rb-Ser780)和p-Rb-Ser608的蛋白水平。结果测序结果提示NUDT21过表达载体构建成功,HCT-116细胞转染NUDT21过表达质粒后,其mRNA和蛋白水平表达量明显升高。过表达NUDT21抑制结肠癌HCT-116细胞增殖,细胞周期阻滞于G0/G1期;过表达NUDT21后,CDK2、p-Rb-Ser608与p-Rb-Ser780蛋白表达量降低,P53蛋白水平增高。结论过表达NUDT21通过阻断P53/CDK2/Rb信号通路抑制结肠癌HCT-116细胞的增殖。

弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ(NTPase-Ⅱ)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-NTPase-Ⅱ并在COS-7细胞中进行瞬时表达。方法以pBAD-HisB-NTPase-Ⅱ质粒为模板,PCR扩增NTPase-Ⅱ目的基因,将其克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,双酶切及测序鉴定重组质粒。阳离子脂质体法转染COS-7细胞并经SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白的表达。结果经鉴定,弓形虫pcDNA3.1(+)-NTPase-Ⅱ核酸疫苗质粒构建成功。以脂质体法转染COS-7细胞后,转染细胞可成功地表达弓形虫NTPase-Ⅱ蛋白。结论证实了弓形虫NTPase-Ⅱ蛋白能在真核细胞中表达,为该基因的核酸疫苗研究提供了实验依据。

苦参碱对角叉菜胶诱导的关节炎大鼠炎症反应及血小板中精氨酸酶和腺苷核苷酸水解酶活性的影响

目的:研究苦参碱对角叉菜胶诱导的关节炎大鼠炎症反应及血小板中精氨酸酶和腺苷核苷酸水解酶活性的影响。方法:将大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药物对照组(0.2 mg·kg^(-1)地塞米松)、苦参碱(低、中、高剂量)(20 mg·kg^(-1)、40 mg·kg^(-1)、80 mg·kg^(-1))组。采用连续7 d关节内注射20μL的1%角叉菜胶构建类风湿关节炎大鼠模型,从第8天起,每天灌胃相应的药物,连续21 d。在给药第0、7、14、21天分别用游标卡尺测量各大鼠爪厚度,并进行关节炎指数评分;HE染色观察软骨损伤;流式细胞术测定大鼠外周血T细胞的功能表型;ELISA法测定大鼠血清中干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)的水平;通过Ehrlich试剂反应产生的尿素浓度来评估精氨酸酶活性;通过硫代巴比妥酸反应检测脂质过氧化;测定NTPD酶、5′-核苷酸酶活性和腺苷脱氨酶活性;蛋白印迹法测T细胞和软骨组织p65和p-IKBα/IKBα蛋白相对表达。结果:苦参碱高剂量组降低角叉菜胶诱导的关节炎大鼠爪厚度和关节炎指数,改善软骨损伤,降低Th1细胞与Th2细胞比例,降低IFN-γ+、IL-1β、IL-8、TNF-α含量,升高IL-4和IL-10含量,降低精氨酸酶活性、TBARS生成及ATP/ADP/AMP水解,增加腺苷脱氨酶活性,降低p65和p-IKBα/IKBα表达。结论:苦参碱能明显改善小鼠关节炎,这可能与其抑制炎症、维持Th1/Th2平衡、降低精氨酸酶和腺苷核苷酸水解酶活性、抑制NF-κB信号传导有关。

急性抗体介导排斥反应中微血栓形成对移植物损伤的机制研究

目的:探讨急性抗体介导排斥反应(Antibody-mediated rejection,AMR)中微血栓形成对移植器官损伤的效应及机制。方法:在三磷酸核苷双磷酸水解酶(NTPDase1)野生型裸鼠皮肤移植模型上诱导急性AMR,用实时荧光定量PCR、倒置显微镜等方法,研究B细胞NTPDase1的表达活性、移植皮肤NTPDase1 mRNA表达量、血小板活化标记物和血小板移动平均速率测定值,及移植皮肤病理变化;补充外源性NTPDase1预处置对血小板活化和移植皮肤损伤的影响。结果:急性AMR发生时,B细胞NTPDase1的表达上调,移植皮肤的NTPDase1 mRNA表达下降,血小板活化、移植皮肤受损;NTPDase1预处置可有效抑制血小板活化、保护移植皮肤。结论:NTPDase1降解胞外ADP失衡可能是急性AMR中移植物损伤的主要原因,中剂量外源性NTPDase1预处置保护移植物有效、安全。

基于信号肽和分子伴侣策略促进大肠杆菌高效转化尿苷

以大肠杆菌作为嘧啶核糖核苷水解酶(pyrimidine-specific ribonucleoside hydrolase RihA,RihA)表达宿主,利用生物转化的方法将尿苷高效转化为尿嘧啶。首先构建pET22b-RihA质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达,研究尿苷的转化情况。采用优化pET22b-RihA质粒信号肽和与分子伴侣质粒共表达两种策略进一步提高大肠杆菌转化尿苷的效率。来源于碱性磷酸酶的PhoA信号肽和分子伴侣GroES-GroEL共表达的菌株F在投底物发酵时转化效果最好,当底物浓度为65 g/L转化15 h时,菌株F几乎将尿苷完全转化,尿苷转化率达到98.9%,而原始菌株A的尿苷转化率仅为80.2%。进一步对菌株F转化尿苷的浓度进行优化,投入一倍体积的尿苷底物后继续培养约53 h尿苷转化完全,得到尿嘧啶产量为73.45 g/L,尿嘧啶产率为98.16%。发酵液上清中RihA酶活最高的为PelB信号肽和分子伴侣GroES-GroEL共表达的菌株C,其RihA酶活是原始菌株A的10.0倍。其中总可溶性RihA酶活最高的为PhoA信号肽和分子伴侣DnaK-DnaJ-GrpE共表达的菌株G,其RihA酶活是原始菌株A的4.45倍。通过优化信号肽和分子伴侣,提高了尿苷的转化效率,并建立了一种高效的利用大肠杆菌全细胞催化生产药物中间体尿嘧啶的方法。与化学合成方法生产相比,避免了繁琐的生产工艺步骤,对环境友好绿色。

急性抗体介导排斥反应中NTPDase1代谢胞外ADP失衡致移植物损伤研究进展

急性抗体介导排斥反应(AMR)治疗效果差,是一种难治性急性排斥反应。在急性AMR发生时,血小板活化、B细胞激活、巨噬细胞功能上调直接或间接导致移植物不可逆性损伤。三磷酸核苷双磷酸水解酶1(NTPDase1)是一个钙、镁离子依赖的核苷三磷酸二磷酸水解酶,可以水解细胞外三磷酸腺苷、二磷酸腺苷(ADP)为单磷酸腺苷。NTPDase1可表达于成熟的B细胞、血小板和巨噬细胞等,维持其胞外ADP平衡,使这些细胞处于静息状态。急性AMR发生时,NTPDase1代谢胞外ADP平衡被打破,改变了B细胞、血小板、巨噬细胞等静息状态,从而导致移植物损伤。因此,NTPDase1相关通路导致的血小板活化、B细胞激活和巨噬细胞功能上调在急性AMR移植物损伤中的作用越来越受到关注。

急性抗体介导排斥反应的发生机制研究进展

器官移植术后排斥反应是影响移植物存活时间的主要原因之一,随着诊疗水平的不断提高,急性抗体介导排斥反应(AMR)在器官移植排斥中的作用逐渐受到重视。与T细胞介导的急性细胞性排斥反应相比,B细胞参与的移植术后急性AMR治疗效果差、患者预后不佳,属于难治性急性排斥反应。急性AMR的发生与血小板活化、微血栓形成、CD39代谢胞外二磷酸腺苷失衡及B细胞激活等有重要关系,研究其发病机制有助于该病的早期诊断及治疗,从而延长移植物的存活时间。

重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷

假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷,在生物和医药领域用途广泛。现有的假尿苷制备方法普遍存在步骤繁琐、生产效率低、生产成本高等缺点。本研究在大肠杆菌中设计了新颖的酶级联反应路线,并实现了全细胞催化尿苷制备假尿苷。首先,质粒过表达内源的假尿苷-5-磷酸糖苷酶、核糖激酶和核糖核苷水解酶,构建出尿苷到假尿苷的代谢途径,实现了假尿苷的积累;然后,筛选内源的高活性核糖核苷水解酶,促进了尿苷的水解,为假尿苷的合成提供了更多前体;接着,对底物与产物的转运途径进行改造,提升假尿苷产量的同时避免了副产物尿苷的积累。最终获得的重组菌株Ψ-7在24 h内可以全细胞催化30 g/L尿苷产生27.24 g/L假尿苷,转化率为90.8%,生产效率为1.135 g/(L·h),假尿苷产量和生产效率为现有酶催化法报道的最高值。