多核糖核苷酸核苷转移酶1在氧糖剥夺诱导心肌细胞凋亡损伤中的作用

目的探讨多核糖核苷酸核苷转移酶1(PNPT1)对氧糖剥夺(OGD)诱导心房肌细胞凋亡的影响和作用机制。方法体外培养HL-1心房肌细胞,PNPT1-siRNA转染HL-1细胞。实验分组为:正常组(Control)、OGD组、NC-siRNA组(转染乱码RNA)、PNPT1-siRNA组、OGD+NC-siRNA组和OGD+PNPT1-siRNA组。通过CCK-8检测细胞存活率,qPCR检测ACTB mRNA和TUBA mRNA的含量,Western blot检测PNPT1蛋白水平,流式细胞术检测HL-1细胞凋亡率,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位,透射电镜观察线粒体形态。结果随OGD诱导时间延长,HL-1细胞质中PNPT1的蛋白表达水平呈上升趋势(P<0.05)。与NCsiRNA相比,PNPT1-siRNA明显减少细胞内PNPT1表达。OGD条件下,ACTB mRNA和TUBA mRNA降解增加(P<0.05),HL-1心房肌细胞凋亡率增加(P<0.05);相反地,PNPT1-siRNA则抑制ACTB mRNA和TUBA mRNA降解(P<0.05),同时降低HL-1心房肌细胞凋亡率(P<0.05),并且改善线粒体膜电位以及线粒体形态。结论抑制PNPT1可改善线粒体损伤并减少凋亡相关mRNA的降解,从而减轻OGD诱导的HL-1心房肌细胞凋亡损伤。

末端脱氧核苷酸转移酶相互作用因子1及其在癌症中的研究进展

末端脱氧核苷酸转移酶相互作用因子1(TdIF1)是一种直接与末端脱氧核苷酸转移酶结合的蛋白质。TdIF1在非小细胞肺癌、口腔癌、乳腺癌中高度表达,且这种高表达可促进癌细胞的生长。文章就TdIF1的结构、功能以及在癌症进展中的作用进行综述,指出TdIF1可能是一种潜在的癌症促进因子,为其成为癌症诊断的潜在标志物及靶向治疗的新靶标提供参考。

基于末端脱氧核苷酸转移酶协同G-四链体核酶的恩诺沙星检测方法

基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)协同G-四链体核酶设计信号放大策略,建立了一种恩诺沙星电化学检测方法。目标物恩诺沙星与特异性核酸适体的结合触发TdT在电极表面的扩增反应,产生G-四链体核酶纳米线结构,进而发挥辣根过氧化物酶活性催化信号放大,实现恩诺沙星的高灵敏和高特异性检测。该方法对恩诺沙星的线性检测范围为0.5~50μg/L,检测限低至0.043μg/L。此外,该无标记电化学生物传感器简单快速,成本低,并成功应用于对实际食品样本的分析检测,显示出较好的应用潜能。

烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1对视网膜发育过程中中央碳代谢稳定性的作用

目的:探讨烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1(NMNAT1)在视网膜发育过程中对于中央碳代谢的作用。方法:构建NMNAT1条件性敲除小鼠及其同窝对照小鼠模型,使用PCR法进行基因型鉴定。在出生后第4天,取NMNAT1敲除小鼠和同窝对照小鼠的视网膜进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)靶向代谢组学检测和全转录组测序。代谢物提取物通过Shimadzu LC Nexera X2 UHPLC与QTRAP 5500 LC-MS/MS联用进行分析,并使用MultiQuant 3.0.3软件对提取的MRM峰进行积分。在NovaSeq6000平台上利用Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit进行全转录组测序,每个样本的总读数深度为100 M。使用FastQC验证读取质量,并使用BBTools包的Bbduk实用程序修剪引物。使用HISAT22.1.0进行读取比对,使用StringTie 1.3.6组装和量化转录本。使用DESeq2 R包鉴定差异表达的基因。结果:与对照小鼠相比,NMNAT1敲除小鼠视网膜中共有39种代谢物的含量发生了显著改变(P<0.05);通过代谢物集富集分析发现多种不同生化途径受到了不同程度的破坏,主要包括氨基酸代谢、糖酵解/糖异生、烟酸和烟酰胺代谢以及嘌呤代谢。其中,NMNAT1敲除组小鼠视网膜总NMNAT1水平和烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)水平降低约40%(P<0.05);烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和烟酸单核苷酸(NAM)的水平分别降低了约25%和55%(P<0.05);线粒体编码的NADH脱氢酶1(MT-ND1)的水平略有降低(P>0.05);上游糖酵解代谢物葡萄糖、葡萄糖6磷酸(G6P)和1,6-二磷酸果糖(F16bP)的水平大幅升高(P<0.05);磷酸二羟基丙酮(DHAP)和葡萄糖3磷酸(G3P)的水平大幅降低(P<0.05);a-KG和琥珀酸的水平降低了约30%(P<0.05);磷酸肌酸和肌酸的水平略有降低(P>0.5);赤藓糖醇(Erythritol)水平显著降低(P<0.05)。结论:NMNAT1缺失会导致视网膜中严重的特异性代谢缺陷,中央碳、嘌呤核苷酸和氨基酸代谢均受到损害,可能是导致严重视网膜变性的原因。

友菌素核苷转移酶amiE基因的克隆、表达和功能鉴定

【目的】克隆和表达二糖核苷类抗生素友菌素生物合成基因簇中的核苷转移酶基因amiE,并研究AmiE的体外催化功能。【方法】采用PCR技术将编码257个氨基酸的葡萄糖-1-磷酸核苷转移酶基因amiE克隆到表达载体pET28a上,构建质粒pCSG4001,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达;利用亲和层析分离纯化蛋白AmiE,以葡萄糖-1-磷酸和胸腺嘧啶三磷酸(TTP)或尿嘧啶三磷酸(UTP)为底物,利用高效液相检测AmiE的体外酶活;以甘露糖-1-磷酸、半乳糖胺-1-磷酸和半乳糖-1-磷酸和TTP作为底物,进一步研究AmiE对底物的选择性。【结果】N-末端融合组氨酸标签的AmiE蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,通过亲和层析纯化出的AmiE能够以TTP(或UTP)和葡萄糖-1-磷酸作为底物,催化形成胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖(TDP-glucose)或者尿嘧啶二磷酸葡萄糖(UDP-glucose),但对其他三种底物,无明显催化活性。【结论】大肠杆菌中表达纯化的核苷转移酶AmiE能够体外催化形成TDP-葡萄糖(或UDP-葡萄糖),确证了AmiE作为核苷转移酶的催化功能,同时表明AmiE对底物具有一定的选择性。

重组大肠杆菌生产核苷磷酸转移酶的发酵条件优化

核苷磷酸转移酶能够特异地将无机焦磷酸(PPi)的磷酸根转移到核苷5′-位的羟基上,该过程并不需要ATP的参与,且具有选择性高和反应条件温和等特点。以实验室前期构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT为菌株,进行了5 L发酵罐中的培养条件优化,确定了以乳糖作为诱导剂时,最佳诱导时机OD600为7左右,诱导剂乳糖的浓度为10 g/L;确定了最适通气量为1.5 L/min。在该条件下,核苷磷酸转移酶酶活达221.4 U/L,OD600为20.4。

人重组烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶2的表达、纯化及酶活力测定

目的:通过大肠杆菌体系诱导表达烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶2(NMNAT2),并测定纯化的重组NMNAT2酶蛋白催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成的酶比活力。方法:在大肠杆菌BL21(DE3)体系优化条件下诱导表达NMNAT2重组蛋白,利用Ni-NTA Superflow Kit进行目的蛋白的纯化,Western blot法进行鉴定,并通过酶联荧光法测定其催化产物NAD,测定其酶活性。结果:人重组质粒NMNAT2-p ET-24a可以在大肠杆菌BL21(DE3)体系中诱导表达。诱导条件为:LB培养液(卡那霉素,15μg/m L)中37℃,IPTG(1.0 m M)诱导表达4 h。纯化获得的NMNAT2重组蛋白具有较高的酶活性。结论:NMNAT2-p ET-24a可在大肠杆菌BL21(DE3)体系中稳定表达,优化条件下可获得较高活性的纯化NMNAT2重组蛋白,可用于神经保护功能及酶蛋白的活性调控研究。

重组核苷磷酸转移酶产生菌培养条件优化

5'-肌苷酸是一种重要的食品增鲜剂。核苷磷酸转移酶能够高选择性地使肌苷5'-位羟基磷酸酯化生成5'-肌苷酸,该反应不需要ATP,具有反应条件温和、反应速度快、位置特异性强、转化率高、环境友好等特点。以实验室前期构建的携带有来自Escherichia blattae磷酸转移酶(AP/PTase)编码基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT为菌株,研究了培养基成分对细胞生长和产酶的影响,确定了最优培养基为:甘油7.5 g/L,蛋白胨12.5 g/L,酵母粉10g/L,NaCl 10 g/L,ZnCl2 0.1 g/L,初始pH值7.0。在该条件下,核苷磷酸转移酶酶活达到143.8U/L,比优化前提高了1.0倍。利用该条件下培养获得的菌体为生物催化剂,反应1 h,5′-肌苷酸的摩尔收率达到83.3%,表明该核苷磷酸转移酶对肌苷具有良好的活性。

幽门螺杆菌重组空泡细胞毒素A片段对人胃腺癌AGS细胞腺嘌呤核苷酸转移酶1基因表达的影响

目的探讨幽门螺杆菌(HP)重组空泡细胞毒素A(VacA)片段对人胃腺癌AGS细胞腺嘌呤核苷酸转移酶1(ANT1)基因表达的影响。方法HPVacA基因片段重组质粒转染AGS细胞后,分别于0、24、48、72 h收集细胞,提取总RNA和总蛋白,应用逆转录聚合酶链式反应和蛋白印迹法检测各时相点ANT1基因的mRNA和蛋白表达变化。结果重组VacA基因片段质粒转染AGS细胞后,ANT1基因mRNA和蛋白表达均随时间呈逐渐升高趋势,各时相点的表达量明显高于对照组(P<0.05)。结论HP可能通过上调ANT1基因的表达,使线粒体膜通透性改变,引起细胞凋亡。

烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的表达、纯化及活性测定

目的获得具有较高纯度和酶活性的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶-1(Nmnat1),为进一步对其功能及调控的研究奠定基础。方法在大肠杆菌中进行Nmnat1表达的条件优化,采用Ni-NTA亲和层析法对目的蛋白进行纯化,并通过酶联荧光法测定酶活性。结果 BL21-CondonPlus (DE3)-RIL为适宜的宿主菌,优化的蛋白表达条件为:在2×YT培养基(37μg/ml氯霉素和75μg/ml卡那霉素)中于28℃、0.5mmol/LIPTG(isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导8h。纯化获得的Nmnat1蛋白具有较高的纯度和酶活性。结论适宜的宿主菌对Nmnat1蛋白的高效表达至关重要,进行表达条件优化后可获得大量具有较高纯度和酶活性的目的蛋白。

基于末端脱氧核苷酸转移酶扩增DNA-铜纳米簇荧光传感检测L-组氨酸

利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)扩增形成聚胸腺嘧啶(T)DNA模板,制备了聚T铜纳米簇(TS-CuNCs),构建了一种用于L-组氨酸(L-His)检测的荧光传感分析新方法。TdT酶在d TTP存在下合成聚T单链DNA核苷酸序列。由于胸腺嘧啶和Cu^(2+)之间的亲合力,聚T单链DNA作为合成铜纳米簇(CuNCs)的模板,加入还原剂后形成CuNCs,荧光强度增强。在L-His存在下,L-组氨酸的咪唑基与Cu^(2+)螯合形成L-His-Cu^(2+)配合物,因而进入聚胸腺嘧啶序列中的Cu^(2+)量减少,使得合成的CuNCs数量减少,导致荧光信号减弱。实验结果表明,体系荧光响应信号与L-His浓度的对数值在5.0×10^(-9)~5.0×10^(-4)mol/L范围内呈线性关系,检出限达到3.4×10^(-9)mol/L。本方法用于实际尿液样品中L-组氨酸检测的回收率为97.4%~104.6%,在生物医学及临床诊断中具有潜在应用价值。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因对体外原代培养神经元轴突发育的影响

目的评价烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(NMNAT)1基因对体外原代培养小鼠神经元轴突发育的影响。方法在体外建立了原代培养小鼠神经元模型,并通过RNA干扰和基因过表达的方法控制NMNAT1基因的表达水平。应用电穿孔转染,上调或下调NMNAT1基因的表达水平,应用免疫细胞化学方法研究神经元轴突形态。在所有的功能试验中,把一种高效的特定的非竞争性NMNAT1抑制剂FK-866(CAS658084-64-1)用作药物学对照。结果在体外原代培养的皮层神经元中下调NMNAT1基因能减缓轴突生长,同时引起轴突分支的减少。结论 NMNAT1基因在原代培养的皮层神经元形态发生中起显著作用,表明NMNAT1基因的丢失可能会引起中枢神经系统神经元变性。

核苷酸转移酶与玉米非生物胁迫响应

核苷酸转移酶(nucleotidyl transferase protein,NTP)能够对RNA 3'末端进行修饰,从而影响其稳定性.通过分析玉米NTP蛋白家族的结构域与拟南芥、水稻中NTP蛋白进化的关系,发现玉米中含有24种NTP基因,并且玉米、拟南芥和水稻3种植物中的NTP基因具有高度同源性与保守性.对玉米NTP基因启动子上游顺式作用元件进行预测分析,结果显示,玉米NTP基因启动子中含有多个与非生物胁迫相关的启动子元件.通过反转录聚合酶链式反应分析在高盐、干旱、植物激素脱落酸的非生物胁迫条件下,玉米NTP相关基因的表达量,研究发现,玉米NTP基因能被非生物胁迫诱导表达.实验表明玉米NTP基因与非生物胁迫相关,且可能参与了植株抵抗逆境胁迫的过程.

抗生素的细菌耐药性:酶降解和修饰

抗生素耐药性通过三种机制而起作用:阻止药物与靶标相互作用;从细胞中排出抗生素;对抗生素的直接破坏和修饰。本文主要讨论抗生素的直接破坏和修饰而失活,这包括:水解、基团转移和氧化还原机制。而水解对于临床非常重要,特别是β-内酰胺类抗生素应用以后。而基团转移有多种途径,包括乙酰基转移修饰、磷酸化、糖基化、核苷酸化、核糖基化和巯基转移。酶对抗生素修饰的唯一特点是,这些机制单独起作用降低了药物在局部环境中的浓度,因而,药物研发者和临床医生面临的挑战是针对这种机制找到抗感染治疗的新方法。本文将概括目前有关抗生素耐药性的一些研究成果,并讨论耐药性酶的分子机制、三维结构及进化,从而克服抗生素的耐药性。

Tom70/PNPT1线粒体转位调控在大鼠心肌细胞缺氧性损伤中的作用及其机制

目的探讨线粒体外膜转位酶70(Tom70)/多核糖核苷酸核苷转移酶1(PNPT1)线粒体转位调控在大鼠心肌细胞缺氧性损伤中的作用及其机制。方法(1)将大鼠H9C2心肌细胞分为对照组(常氧条件培养12h)与缺氧组(缺氧干预12h),采用流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,qPCR检测TUBA mRNA表达情况,Western blotting检测PNPT1蛋白表达情况。(2)利用携带Tom70序列的慢病毒载体转染H9C2细胞,分为NC组(慢病毒阴性对照组,转染慢病毒空载体)、Tom70过表达组(转染携带Tom70序列的慢病毒载体)、缺氧+NC组、缺氧+Tom70过表达组,采用Western blotting检测各组Tom70、PNPT1蛋白表达水平,采用流式细胞术检测缺氧+NC组、缺氧+Tom70过表达组细胞凋亡率,qPCR检测缺氧+NC组、缺氧+Tom70过表达组TUBA mRNA表达情况,免疫共沉淀技术检测细胞中Tom70与PNPT1的相互作用情况。结果(1)流式细胞术检测结果显示,与对照组比较,缺氧组细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。qPCR检测结果显示,与对照组比较,缺氧组细胞中TUBA mRNA含量明显减少(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,与对照组比较,缺氧组线粒体内PNPT1蛋白表达水平明显降低,而胞质PNPT1蛋白表达水平明显上升(P<0.05)。(2)Western blotting检测结果显示,与对照组和NC组比较,Tom70过表达组细胞内Tom70表达量明显增加(P<0.05);常氧条件下,NC组与Tom70过表达组线粒体及胞质中的PNPT1表达均无明显差异,而缺氧条件下,与缺氧+NC组比较,缺氧+Tom70过表达组线粒体PNPT1表达水平明显升高,胞质PNPT1表达水平明显降低(P<0.05)。免疫共沉淀结果显示,心肌细胞中的Tom70与PNPT1能够相互结合。流式细胞术检测结果显示,与缺氧+NC组比较,缺氧+Tom70过表达组细胞凋亡率下降(P<0.05)。qPCR检测结果显示,与缺氧+NC组相比,缺氧+Tom70过表达组TUBA mRNA表达水平明显增高(P<0.05)。结论Tom70可通过调控PNPT1的线粒体定位表达减少凋亡相关mRNA的降解来减轻大鼠心肌细胞缺氧性损伤。

基于双重脱氧核酶的超灵敏比色法检测铜离子

铜是生命的必需元素,是某些活性蛋白的辅基,而过量的铜具有一定毒性,可导致肝炎、胃肠炎、肺炎等病症。因此对Cu^(2+)的灵敏定量检测十分必要。本研究建立了一种基于双重脱氧核酶的比色生物传感器,用于灵敏、特异性定量检测Cu^(2+)。此生物传感器包含两种具有不同功能的脱氧核酶:Cu^(2+)依赖性的切割型脱氧核酶与G-四链体脱氧核酶。当待测物中存在Cu^(2+)时,Cu^(2+)依赖性的切割型脱氧核酶被切割,用于特异性信号识别;经末端转移酶诱导形成G-四链体脱氧核酶,用于"一对多"的信号放大与可视化信号输出。在"信号识别"与"信号输出"两步反应之间,利用指数扩增反应(Exponential amplification reaction,EXPAR),放大"信号识别"的反应信号。在最优条件下,可实现Cu^(2+)的灵敏的选择性检测:使用全波长酶标仪测定,比色法检出限为7.6 pmol/L;裸眼检出限为10 pmol/L。将此传感器用于自来水中Cu^(2+)的测定,裸眼检测范围为10～200 pmol/L,比色法加标回收率为96.3%～98.4%。此检测平台为特异性检测自来水中的Cu^(2+)提供了超灵敏、可视化的检测工具,具有良好的应用前景。

过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因(ldhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因(pflB)的发酵生产丁二酸的潜力菌株。厌氧条件下NADH不能及时再生为NAD+,引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡,最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖生长代谢。nadD为催化NAD(H)合成途径中烟酸单核苷酸(NaMN)生成烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)的烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(Nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase,NAMNAT)的编码基因,通过过量表达nadD基因能够提高NAD(H)总量与维持合适的NADH/NAD+比例。文中构建了重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-nadD,在厌氧摇瓶发酵过程中通过添加终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达,重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-nadD中NAD+和NADH的浓度分别比宿主菌E.coli NZN111提高了3.21倍和1.67倍,NAD(H)总量提高了2.63倍,NADH/NAD+从0.64降低为0.41,使重组菌株恢复了厌氧条件下生长和代谢葡萄糖的能力。重组菌与对照菌相比,72 h内可以消耗14.0 g/L的葡萄糖产6.23 g/L的丁二酸,丁二酸产量增加了19倍。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因对原代培养小鼠神经元活力的影响

目的评价烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶I（NMNATl）基因对原代培养小鼠神经元活力的影响。方法取原代培养神经元，分成正常对照组、过表达NMNATl慢病毒感染组、RNA干扰慢病毒感染组，后两组分别感染小鼠NMNATl基因的过表达和RNA干扰慢病毒颗粒以上调和下调NMMT1基因的表达水平。应用MTT染色观察各组原代培养小鼠神经元活力的变化。结果与正常对照组原代培养小鼠神经元活力比较，过表达NMNAT1慢病毒感染组神经元的细胞活力显著增强，而RNA干扰慢病毒感染组神经元的细胞活力受到严重干扰，差异有统计学意义（P=0．025．P=0．027）。结论NMNAT1基因在神经元发育过程中起重要作用，其缺失可能导致中枢神经系统的神经退化。

TdT阴性的淋巴母细胞淋巴瘤/急性淋巴细胞白血病临床特点、诊断及预后研究进展

末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotide transferase,TdT)是一种特殊类型的DNA聚合酶,它可以在无DNA复制模板的条件下将单个脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'-OH端。TdT是造血系统中不成熟淋巴细胞中特异性较强的细胞内标记,在淋巴源性肿瘤的诊断中具有重要意义。淋巴母细胞淋巴瘤/急性淋巴细胞白血病(lymphoblastic lymphoma/acute lymphoblastic leukemia,LBL/ALL)的诊断依赖免疫分型。TdT通常在LBL/ALL中呈阳性表达,是临床诊断LBL/ALL的重要依据。TdT阴性的LBL/ALL在临床中较为少见,鉴于该分子诊断特异性较高,其阴性表达会给诊断带来一定的困难。TdT阴性的原因有多种,在淋巴细胞不同分化阶段中TdT的表达情况不同,另因不同检测方法的灵敏度不同,也可导致偶见TdT的假阴性。此外,有文献指出TdT阴性与TdT阳性的LBL/ALL在临床特点及预后方面亦不相同。了解TdT的表达意义、阴性的原因,以及阴性或阳性表达的LBL/ALL的不同特点,有助于临床诊断、治疗选择及预后判断。该文对国内外相关文献进行了梳理,就TdT阴性的原因及其表达阴性的LBL/ALL的临床特点、诊断及预后等进行综述。