质粒pXZ10145核苷酸序列测定和分析

以Sanger双脱氧中止法为原理,利用美国ABI公司370A自动核酸序列分析仪,我们测定了谷氨酸棒杆菌质粒pXZ10145全长4887bp的核苷酸序列,该质粒上存在包括ApaI等18种限制酶的单一切点,其它限制酶切点的数目和位置也被定出,质粒上有8个可能的阅读框架,通过序列分析,我们确定了pXZ10145断裂生成缺失突变体pNAT65的两侧位点,在两个断裂点上发现存在'ATCTAGC'7个碱基的同向重复序列。

口蹄疫病毒强毒株China/99 P2区核苷酸序列测定及比较分析

以口蹄疫病毒强毒株China/99RNA为反转录模板 ,用一对特异性引物扩增目的cDNA ,然后与 pGEM TEasy载体连接并转化JM10 9菌株 ,再经重组质粒电泳、PCR和EcoR1酶切鉴定。序列测定和分析结果表明 ,该强毒株与A12、O1K和TW 45毒株的核苷酸差异率分别为 7 78%、6 6 2 %和 13 19%。推导的氨基酸序列差异率分别为 1 2 3%、1 84%和 5 73%。 4个毒株序列比较发现 ,China/99、O1K和TW 45三毒株的 2A/2B连接处为甘氨酸 /脯氨酸 ,A12 为精氨酸 /脯氨酸 ,而且T C转换率和A G转换率较高 ,是点突变的热点核苷酸。氨基酸差异主要存在于 2B和 2C蛋白中 ,2A基因较为保守。 2B蛋白的第 1 4,6 3 6 7,73 78,83 91,116 12 1和 12 6 131区域 ,2A蛋白的第 4 9区域和 2C蛋白的第 9 13,2 2 2 5 ,91 96 ,15 0 15 9,179 188,2 0 1 2 0 7和 2 5 8 2 6 2区域可能是重要的活性中心。

汉滩病毒西安分离株84FLi的L片段核苷酸序列测定以及分析

采用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR) ,分节段扩增汉滩病毒 84FLi株的L基因片段cDNA ,纯化的PCR产物片段直接用于序列测定或克隆入 pND18 T载体中进行测序。结果表明 ,84FLi株的L片段cDNA由 6 5 33个核苷酸组成 ,四种核苷酸的比例分别为A33.39% ,C16 .4 3% ,G2 0 .74 % ,T2 9.4 4 %。GC含量为 37.17% ,AT含量为6 2 .83%。推导出的最大开放读码框架为从 38到 6 4 93,共编码 2 15 1个氨基酸。序列同源性分析表明 ,84FLi株核苷酸与HTN型国际标准毒株 76 118的同源性为 83.7% ,差异性为 18.8% ;而与中国株A9的同源性高达 97.6 % ,差异性仅为 2 .4 %。与SEO型代表Seoul80 39的同源性为 75 .2 % ,6 6 .1%～ 6 6 .5 %。L片段的氨基酸比较分析表明 ,L片段与HTN型间的同源性为 97.5 %～ 98.0 % ,而与SEO型的同源性为 83.5 %～ 85 .5 %。与PUC、TUL、SN和AND等其它型汉滩病毒的同源性仅为 6 8.6 %～ 6 9.6 %。结果表明 84FLi株属于HTN型 。

一株新型散发型戊型肝炎病毒部分核苷酸序列测定与分析

目的 :了解长春地区戊型肝炎病毒 ( HEV)株的变异程度。方法 :用逆转录 -套式 -聚合酶链反应方法从患者血清中获取病毒 ,用双脱氧终止法进行核苷酸序列分析。结果 :China Changchun-2 2 0 MC与日本株、猪的 HEV分离株 ( AF0 82 843)、美国株 - 1 ( AF0 60 669)、墨西哥株 ( M745 0 6)、第四基因型 ( AJ2 72 1 0 8)、缅甸株 ( M732 1 8)、中国株 ( M941 77、D1 1 0 93、D1 1 0 92 )、尼泊尔株 ( AF0 5 1 830 )、巴基斯坦株 ( M80 5 81、AF1 85 82 2 )核苷酸同源性为 72 %～ 88% ,氨基酸同源性为 93%～ 97%。结论 :China Changchun- 2 2 0 MC株与其它 HEV株相比有较高的基因异质性 ,可能是一新型的

猪水泡病病毒结构蛋白编码区核苷酸的序列测定与分析

以猪水泡病病毒 (Swinevesiculardiseasevirus ,SVDV)HK’70为材料 ,用特异性引物扩增出P1区的 2个重叠目的片段 ,连接于pMD 18 T载体 ,转化JM 10 9感受态细胞。经重组质粒的双酶切 ,PCR鉴定后测序。序列分析表明 ,HK’70P1区核苷酸组成中A含量较高 ,G +C含量较低 ,且A G、C T转换率较高。P1序列同源性分析表明 ,SVDVHK’70与J1’73、H/3’76、SVDV(Seechurn等测株 )、NET/1/92的核苷酸序列同源性分别为 97.8%、98.1%、97.6 %和 89.3% ;相应地 ,推导的氨基酸序列同源性分别为 98.8%、98.7%、98.8%和 96 .5 %。

口蹄疫病毒株China/99L区段核苷酸序列测定及比较分析

以口蹄疫病毒株China/ 99RNA为模板 ,反转录并扩增目的cDNA ,然后与 pGEM TEasy载体连接并转化JM10 9菌株 ,提取的重组质粒用电泳、PCRampos和EcoR1酶切法鉴定。该毒株与A10、O1K、O1Campos和TW 45毒株的核苷酸序列差异率分别为 15 .2 7%、15 .5 6 %、15 .5 6 %和 15 .49% ;氨基酸序列差异率分别为 8.2 9%、8.76 %、9.2 2 %和 10 .14%。五个毒株的L/P1连接处均为苷氨酸 (Gly) /异亮氨酸 (Ile)。序列比较表明 ,T C、A G和A C转换率较高 ,是点突变的热点核苷酸 ,是影响氨基酸稳定的因素之一。第 43 5 3、95 10 5、10 8 111、146 15 3、16 1 173、183 188和 182 187区域极有可能是L蛋白酶的活性中心 ,第 48位的H、5 1的C、6 5位的E、95位的H、10 9位的H、138位的H、148位的H和 16 5位的E可能是L蛋白酶的活性位点 。

核苷酸序列分析法在测定HFRSV Chen株型别中的初探

作者用PCR方法扩增了HFRSV Chen株M片段3′末端基因,将之克隆入PUC_(18)质粒,测定出该基因片段的核苷酸序列。通过将该序列与已知6株不同型别HFRSV M片段相应部分进行比较,发现Chen株与76-118株同源性最高,而与其它株差别较大,推测两者是同属一个血清型的不同毒株。本文所应用的方法,对HFRSV基因分型研究及分子流行病学调查都有一定意义。

我国分离的肠道病毒71型(SHZH03病毒株)全基因组核苷酸序列分析

对肠道病毒 71型 (enterovirus 71 ,EV71 )中国 (深圳 )分离株SHZH0 3进行了全基因组 (未包括多聚腺苷尾 )74 0 6个碱基的核苷酸序列测定。结果表明 ,SHZH0 3株与其它肠道病毒 71型毒株相比 ,在编码区没有核苷酸的缺失和插入 ,其 5′UTR和 3′UTR区的长度和序列有一定的差异。核苷酸同源性比较结果表明 ,在P1区SHZH0 3株与SHZH98株、中国台湾流行株 (TW 2 0 86、TW 2 2 72 )的同源性较高 (分别为 92 .5 % ,90 .1 %和 87.9% ) ,与新加坡流行株SIN5 6 6 6、SIN5 86 5及标准株MS、BrCr的同源性则在 81 %左右 ,而与CoxsackievirusA1 6 (Cox .A1 6 )的同源性最低 (6 3.6 % )。氨基酸同源性比较结果表明 ,在P1区SHZH0 3株与Cox .A1 6的同源性最低 ,但在P2和P3区SHZH0 3株与Cox .A1 6的同源性最高。P1区的遗传进化分析表明 ,SHZH0 3株和中国台湾 1 998年流行的EV71毒株的亲缘关系较近 ,属于同一型 (genogroup) ,而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远。

鹅副粘病毒F基因的克隆测序及核苷酸序列分析

以鹅副粘病毒 (GPV) SF0 2株的基因组 RNA为模板 ,通过 RT- PCR的方法扩增出 F基因片段 ,然后将其克隆至 T载体中。经 PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出 F基因的全序列。与 Gen Bank下载的 9株参考毒株比较 F基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测 GPV- SF0 2毒株与参考毒株 L Z- NDV核苷酸序列同源性为 96 %,与F48E9同源性为 92 .5 %,与 L a Sota为 88%。

轮状病毒VP4、VP7基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应 (RT_PCR)技术 ,从轮状病毒感染的细胞中扩增 816bp、916bp的VP4、VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM_T上 ,转化至受体菌DH5α中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定 ,证明重组质粒pT_V4、PT_V7中含有轮状病毒的VP4、VP7基因片段。经核苷酸序列分析 ,表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4。

汉滩病毒M片段的核苷酸序列变异和系统发生树分析

The total RNA was extracted from two clinical blood samples of HFRS patients and the RNA was amplified by RT-PCRThe amplified DNA fragment of sample 613 involved nucleotides 1,471-1,873,and the sample 226 involved 540-1,244 nucleotides of M fragment of Hantaan virusThen the amplified PCR products were sequenced directlyThe sequencing results demonstrated that there was 84% identity between sample 613 and HV114 virus strain,but was 99% between sample 613 and HTN76-118 strainHowever,in sample 226,there was 95% sequence identity with HV114,82% with HTN76-118The results of phylogenetic tree analysis showed that HV613 was located in the same linage with HTN76-118,the HV226 was in the same linage with HV114 and A9

抗隐孢子虫子孢子表膜单链抗体基因的克隆和核苷酸序列分析

应用 RT- PCR技术 ,从分泌具有抗隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 3D6中扩增出抗体VH 和 VL 基因 ,用 linker(Gly4 Ser) 3基因 ,将 VH 和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆至 p MD- 18T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 72 0 bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH和 VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 (A)和轻链 κ 家族。

水稻中富含亮氨酸的重复序列和核苷酸结合位点(LRR-NBS)基因家族的生物信息学分析

采用HMM(HiddenMarkovModel) ,对源于日本晴的粳稻 (国际水稻测序计划 ,IRGSP)基因组和 9311的籼稻基因组 (北京华大 ,BGI)的蛋白质数据库进行了搜索 ,分别获得了 32 5和 344个富含亮氨酸的重复序列和核苷酸结合位点 (leucinerichrepeat-nucleotidebindingsite ,LRR -NBS)类的抗病基因的蛋白序列 ,并得到了与这些蛋白相应的cDNA序列。对粳稻蛋白功能结构域的分析表明 ,多个蛋白具有与植物防卫反应相关的结构域 ,还发现多个蛋白中存在着与转座 /反转座酶或蛋白所具有的结构域。对 2套数据同源性分析表明 ,粳稻中 4 8个基因在籼稻中可以确定存在orthologs基因 ,且几乎所有的粳稻基因在籼稻中都存在高度同源的对应基因。对这些蛋白的表达情况进行了EST库搜索 ,确定粳稻和籼稻中分别有 95和 79个蛋白表达。对粳稻和籼稻的所有LRR NBS类蛋白的NBS结构域氨基酸序列进行了多序列比对和系统进化分析 ,在粳稻中可以确定为 2 6 3个簇 ,这些簇大多只含 1个基因 ,是一个冗余度不高的基因家族。且除了个别族外 。

福建省肠道病毒71型分离株(2010FJLY008)全基因组核苷酸序列分析

目的了解肠道病毒71型在福建省的遗传背景,追踪EV71流行过程中可能发生的变异。方法对2010年福建1例手足口病患儿标本中分离到的1株肠道病毒71型分离株(2010FJLY008)进行全基因组核苷酸序列测定,并对基因组序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果 2010FJLY008株全长7 403bp,核苷酸及编码氨基酸序列同源性比较,均与08年阜阳流行株Fuyang17.08-2同源性最高,整个基因组核苷酸同源性为98.2%,氨基酸同源性为99.5%;全长基因组核苷酸序列遗传进化分析及VP1区基因遗传进化分析,与Fuyang17.08-2株进化关系较为接近,同属于C4a基因亚型。结论 2010年福建省EV71型病毒流行株(2010FJLY008)在病毒基因组结构、基因组核苷酸同源性比较、编码氨基酸同源性比较、全长基因组核苷酸序列遗传进化分析及VP1区基因遗传进化分析等方面,均与2008年阜阳流行株(Fuyang17.08-2)关系密切,未产生明显的抗原漂移及变异。

大肠杆菌不耐热性肠毒素LT_B基因的克隆及其核苷酸序列分析

用内切酶ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切大肠杆菌质粒ｐＥＷＤ２９９，回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段，再将载体ｐＵＣ１８用ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，最后将ｐＵＣ１８ＤＮＡ与５０５ｂｐ的ＬＴＢＤＮＡ进行连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＳａｃⅠ／ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１。再将ｐＸＬＴ１进行ＥｃｏＲⅠ酶切、大肠杆菌聚合酶ⅠＫｌｅｎｏｗ大片段补平、ＨｉｎｄⅢ酶切处理，然后与用ＨｉｃⅡ和ＨｉｎｄⅢ酶切的ｐＵＣ１８连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＸｂａⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１－１。将质粒ｐＸＬＴ１－１进行核苷酸序列分析。

产气荚膜梭菌的β_2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析

利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌中国标准株C5 9— 4 4基因组DNA中扩增出了约 0 .7kb的基因 ,并将其克隆到pGEM T载体上 ,经酶切鉴定及核苷酸序列分析表明 ,该基因片段的核苷酸序列与国外报道的 β2 毒素基因序列一致 .

大肠杆菌菌毛抗原K_(99)基因的亚克隆及核苷酸序列测定

利用PCR技术 ,从含有大肠杆菌菌毛抗原K99基因的质粒pX5K中扩增出 0 .4kb的K99菌毛抗原基因 ,然后将其亚克隆到pGEM T easy载体上 ,并转化至受体菌JM10 9中 ,采用碱性裂解法提取质粒DNA后 ,经NcoI和EcoRⅠ双酶切分析和核苷酸序列分析 。

鼻咽癌恶性转化基因Tx核苷酸序列分析

从人类鼻咽癌细胞系CNE2基因组DNA文库中克隆一个恶性转化基因Tx转染小鼠JB6 + 细胞 ,使细胞恶性转化 ,宿主细胞具有停泊非依赖生长的特性 .已经报道的Tx中一个 3 0kb片段(Tx3 0 )的序列分析结果表明 ,Tx包含人类免疫球蛋白κ轻链完整的J区 .进一步对Tx全长进行亚克隆和测序 ,并采用生物信息学方法进行分析表明 ,Tx包含人类Igκ完整的J区、C区基因片段、还有 5个重组信号序列 ,1个核基质结合序列和 1个N segment的插入 .Tx与正常人IgκJ、C区比较只是在某些位点存在碱基的缺失、插入或置换 ,二者同源性高达 98% ,其电子定位于 2p11 2 ,这与人Igκ的染色体定位是一致的 .可以认为 。

4株猪瘟流行野毒株病毒结构蛋白E2基因的核苷酸序列分析

应用RT PCR和nPCR扩增由 4株甘肃省近期 ( 1997— 1998)猪瘟流行野毒株的E2基因 ,将其克隆到pGEM TEasy载体上 ,经转化、筛选、鉴定后 ,测出核苷核序列。 4株流行毒株的E2基因核苷酸序列同源性为 89.2 %— 99.7% ,相应的氨基酸序列同源性为 93 .8%— 99.0 %。这 4株流行毒株 ;与C 株 (疫苗种毒 )E2基因的核苷酸序列同源性为82 .2 %— 84.3 % ,相应的氨基酸序列同源性为 87.9%— 90 .2 % ,表明近期猪瘟流行毒株与C 株的 gp5 5蛋白之间存在一定的差异。

易变山羊草抗禾谷孢囊线虫基因中核苷酸结合位点区(NBS)的克隆及序列分析

大部分已克隆的植物抗病基因都包含有核苷酸结合位点区 (NBS)和富含亮氨酸的重复序列区 (LRR) .利用来自节节麦的抗禾谷孢囊线虫基因Cre3位点NBS区保守序列设计特异引物 ,从含有来自易变山羊草的抗禾谷孢囊线虫基因的小麦品系E 10的基因组中PCR扩增得到一条约 5 30bp的单一条带 .将扩增条带克隆和序列分析发现 ,该克隆 (Rccn4 )的编码区长 5 2 8bp ,含一个不完整的开放读码框 ,没有起始密码子、终止密码子和内含子结构 ,它编码一个 176个氨基酸残基的蛋白质 ,分子量为 2 0 4kD .Rccn4含有NBS LRR类抗病基因NBS区共有的保守模体I(V)LDD、T(T S)R、G(L S)PLA(A I L)、RCF(A L)Y ,并且与Cre3基因的NBS编码区核苷酸和氨基酸同源性分别为99 4 %和 98% .