整合子中氨基糖苷-3′′-腺苷酰基转移酶多克隆抗体的制备与初步应用

目的制备氨基糖苷-3′′-腺苷酰基转移酶[AAD（3）]特异性抗血清，并探讨其在检测第1类整合子8种不同可变区启动子（PcS、PcH2、PcHl、PcW、PcS。P2、PcH2．P2、Pertl．P2和PcW—P2）下游基因盒中aadA2基因表达水平的应用价值。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增aadA2基因，并克隆至表达载体pETl9b中，诱导表达并纯化带组氨酸标签的重组AAD（3′′）蛋白，免疫大耳白兔制备抗AAD（3′′）特异性抗血清。以制备的抗AAD（3）抗血清为一抗，用免疫印迹法（WB）检测不同可变区启动子下游基因盒中aadA2基因的翻译水平，用微量肉汤稀释法检测链霉素对含不同可变区启动子及其下游aadA2基因盒的大肠埃希菌JMl09的最低抑菌浓度（MIC）。结果成功构建重组的AAD（3′′）蛋白表达质粒pETl9b—aadA2，经测序确认转化大肠埃希菌BL21（DE3）获得1株高表达可溶性重组AAD（3′′）蛋白的工程菌株，发酵后用镍柱纯化获得纯度〉90％的重组AAD（3′′）蛋白，免疫大耳白兔获得效价〉l：100000的抗AAD（3′′）特异性抗血清。WB检测8种不同可变区启动子下游aadA2基因翻译产物AAD（3′′）蛋白的表达水平，设定启动子Pcw下游AAD（3”）蛋白的相对表达水平为1，重复3次测得启动子PcS、PcH2、PcHl、PcS—P2、PcH2一P2、PcHl一P2及PcW—P2下游AAD（3′′）蛋白相对表达水平依次为12．9±2．3、9．1±1．0、2．0-t-O．4、16．0±1．3、14．1±1．3、10．5±0．7、8．9±1．7，且不同可变区启动子下游AAD（3′′）蛋白的相对表达水平差异具有统计学意义（F=32．421，P〈0．01）。微量肉汤稀释法重复3次测得链霉素对含启动子PcS、PcH2、PcHl、PcS—P2、PcH2一P2、PcHl-P2、PcW、PcW．P2及其下游aadA2基因重组质粒的大肠杆菌JMl09的MIC平均值依次为256、256、64、128、32、128、4、64mg／L，表明不同可变区启动子下游aadA2基因的表达水平不同可赋予宿主细菌对链霉素产生不同水平的耐药。结论成功纯化出可溶性重组AAD（3′′）蛋白，免疫大耳白兔获得高效价的抗AAD（3′′）特异性抗血清，为进一步研究整合子中整合酶基因与可变区基因盒表达之间的相互关系奠定基础。不同可变区启动子下游耐药基因盒的表达水平明显不同，赋予宿主细菌对相应抗菌药物的耐药水平明显不同，因此在对临床菌株进行第1类整合子分子流行病学调查时，应重视可变区启动子分类方面的研究。（中华检验医学杂志，2012，35：227-232）