Aβ影响神经细胞中RXRα与Nur77的核质穿梭

目的探讨β淀粉样蛋白(Aβ)对维甲类X受体α(RXRα)、孤儿核受体Nur77的生成和亚细胞定位的影响。方法用Aβ25~35处理小鼠脑神经瘤细胞(N2a)细胞,并以阿尔茨海默病(AD)模型小鼠的大脑皮层和海马组织为研究对象。应用实时荧光RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测N2a细胞和皮层、海马组织中RXRα、Nur77 mRNA表达和蛋白表达,应用核质分离结合Western印迹检测N2a细胞中RXRα、Nur77蛋白在细胞核与细胞质中的含量,应用免疫荧光技术观察N2a细胞与皮层、海马细胞中RXRα、Nur77的亚细胞定位;流式细胞仪检测N2a细胞凋亡情况,Western印迹检测Bcl-2和Bax表达量。结果 N2a细胞经Aβ处理24 h后,RXRαmRNA表达水平下降了16.47%,Nur77 mRNA表达水平无明显变化;RXRα、Nur77总蛋白量无明显变化,但RXRα与Nur77在细胞质中的含量分别由对照组的2.99%、3.91%增至处理组的21.4%、24.2%;Bcl-2蛋白表达下降,Bax表达量上升,细胞凋亡率从对照组1.23%增至Aβ25~35处理组18.69%;与对照小鼠比较,AD小鼠中RXRα、Nur77 mRNA表达水平在大脑皮层无明显差异,但在海马中分别增加了8.67%、11.73%;RXRα、Nur77总蛋白量变化无明显差异,但亚细胞定位发生改变,从细胞核迁移至细胞质增加并伴有凋亡发生。结论 Aβ可能诱导RXRα与Nur77从细胞核迁移至细胞质,诱发凋亡。

LPL在U251细胞中的表达及核质穿梭对其增殖、生长的影响

目的:观察脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipas,LPL)在人胶质瘤U251细胞系中的表达及在leptomycin B(LMB)作用下对其增殖、生长的影响。方法:将经体外培养的U251细胞加入染色体区域稳定蛋白1(CRM1)抑制剂LMB后,分别于12 h和24 h观察细胞核与细胞质LPL表达情况,并利用MTT和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。结果:加入5、10 nmol/L的LMB孵育12 h和24 h后,细胞核内LPL的表达明显增加,且呈剂量依赖性变化,其中10 nmol/L的LMB孵育24 h,细胞核内LPL增高最明显;MTT显示,对照组和各实验组A值分别为(0.82±0.08)、(0.71±0.03)、(0.70±0.04)、(0.69±0.07)和(0.68±0.09),各实验组和对照组之间差异有统计学差异(P<0.05);流式细胞术检测显示各实验组与对照组U251细胞的凋亡率分别为2.81±0.33、4.17±0.24、5.25±0.31和6.80±0.42,各实验组与对照组间差异有统计学差异(P<0.05)。结论:LPL在U251细胞中的核质穿梭是依赖CRM1的,且LMB可以显著增加LPL在细胞核内的表达。随着LMB的浓度增加和孵育时间的延长,U251细胞的增殖和凋亡也受到显著的影响,提示核质穿梭可能对肿瘤的生长有一定的影响。

LPS、poly(i:c)对BV-2小胶质细胞中HMGB1核质穿梭的影响

运用荧光定量PCR方法确定细菌细胞壁的组成成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、病毒模拟物聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly(i:c))对BV-2小胶质细胞中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)核质穿梭影响的最佳作用质量浓度和时间;免疫荧光方法观察BV-2小胶质细胞活化的特异性标志物IBA-1以此确定LPS、poly(i:c)能否激活BV-2小胶质细胞;Western blot方法检测LPS、poly(i:c)诱导BV-2小胶质细胞中促炎细胞因子(IL-1β、TNF-ɑ、NLRP3和iNOS)的蛋白表达量变化;分离细胞核、细胞质蛋白分别检测细胞质和细胞核组分中的HMGB1。结果显示,终质量浓度为10μg/L LPS、50 ng/L poly(i:c)、刺激时长6 h时能够显著增加促炎因子蛋白表达量;免疫荧光结果显示在LPS、poly(i:c)刺激下,BV-2小胶质细胞激活;核质分离结果显示BV-2小胶质细胞被LPS、poly(i:c)刺激后,HMGB1细胞质移位增加。结果表明,细菌或病毒感染都能够使BV-2小胶质细胞内的HMGB1由细胞核向细胞质移位。

分化抑制因子1参与氧化型低密度脂蛋白调控的血管新生

目的探讨分化抑制因子1(Id1)蛋白是否参与氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)调控的血管新生,并阐明Id1参与血管新生的机制。方法通过体外内皮细胞管腔形成和大鼠胸腹主动脉血管环实验来研究低密度脂蛋白对血管新生的调控作用,West-ern blot分析ox-LDL对Id1表达的影响,免疫荧光检测ox-LDL对Id1分布的调控。并通过信号通路抑制剂来分析Id1受ox-LDL调控的分子机制。结果低浓度的ox-LDL促进血管新生,而高浓度的ox-LDL抑制血管新生。ox-LDL上调内皮细胞Id1蛋白的表达,当ox-LDL浓度为5 mg/L时,Id1蛋白的表达显著上调,并且随着ox-LDL浓度增加,Id1蛋白表达继续上调,但相互之间并没有显著差异。高浓度的ox-LDL显著上调Id1蛋白的表达而抑制血管新生。我们进一步研究ox-LDL对内皮细胞Id1分布的影响,发现低浓度的ox-LDL促进Id1蛋白出核,而高浓度的ox-LDL抑制Id1蛋白出核。通过使用蛋白出核抑制剂lyptomycin B,我们发现ox-LDL调控Id1蛋白出核受CRM1/exportin信号控制。进一步通过使用PKA抑制剂H89和PI3K抑制剂LY294002研究发现低浓度的ox-LDL促进Id1蛋白出核是受PI3K信号通路控制的。结论 PI3K信号通路通过促进Id1蛋白出核参与低浓度ox-LDL上调的血管新生。

HSD1蛋白在精子发生过程中的空间特异性表达

目的研究HSD1蛋白在各级生精细胞中的空间特异性表达及其在细胞中的核质穿梭特性。方法分离小鼠生精细胞,用免疫荧光法观察HSD1蛋白的内源定位。构建pEGFP-C1-HSD1融合表达质粒并转染CHO细胞,用激光共聚焦和电镜观察HSD1融合蛋白的定位及其核质分布情况。结果 HSD1蛋白在初级精母细胞和圆形精子细胞的胞质中表达;在成熟精子细胞中主要表达于顶体和尾部。HSD1蛋白在CHO细胞中存在3种分布形式:细胞核型、细胞质型和核质分布型。进一步研究发现该蛋白在细胞中呈动态分布,存在细胞核-质间的穿梭特性。结论HSD1蛋白在生精细胞中呈空间特异性表达并且具有核质穿梭能力。

P68 RNA helicase is a nucleocytoplasmic shuttling protein

P68 RNA helicase is a prototypical DEAD box RNA helicase. The protein plays a very important role in early organ development and maturation. Consistent with the function of the protein in transcriptional regulation and pre-mRNA splicing, p68 was found to predominately localize in the cell nucleus. However, recent experiments demon- strate a transient cytoplasmic localization of the protein. We report here that p68 shuttles between the nucleus and the cytoplasm. The nucleocytoplasmic shuttling of p68 is mediated by two nuclear localization signal and two nuclear exporting signal sequence elements. Our experiments reveal that p68 shuttles via a classical RanGTPase-dependent pathway.