双路通脑方调节SIRT1/Nrf2/GPx4信号通路对缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡的影响

目的探讨双路通脑方对缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡的作用以及对沉默信息调节因子2同源物1(SIRT1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)信号通路的调节机制。方法采用随机数字表法选取20只大鼠作为假手术组,剩余70只大鼠均利用大脑中动脉闭塞法制备缺血性脑卒中大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、双路通脑方组、双路通脑方+SIRT1抑制剂组(双路通脑方+EX527组),每组20只。14 d后,对大鼠进行神经功能损伤评分;TTC染色检测大鼠脑梗死面积;HE染色检测大鼠脑组织病理变化;尼氏染色检测大鼠脑组织神经元数量;试剂盒检测大鼠脑组织中铁离子(Fe^(2+))、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的水平;免疫组化检测大鼠脑组织中酰基-辅酶a合成酶长链家族成员4(ACSL4)、转铁蛋白受体(TFR)、铁蛋白重链多肽1(FTH1)蛋白的阳性表达;Western blotting法检测大鼠脑组织中SIRT1、Nrf2、GPx4及胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(SLC7A11)蛋白的表达。结果与假手术组比较,模型对照组大鼠的神经功能缺损评分、脑梗死面积、Fe^(2+)和MDA含量、ACSL4、TFR蛋白表达升高(P<0.05),神经元数量、SOD和GSH含量、FTH1、SIRT1、Nrf2、GPx4及SLC7A11蛋白表达均降低(P<0.05);与模型对照组比较,双路通脑方组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、Fe^(2+)和MDA含量、ACSL4、TFR蛋白表达降低(P<0.05),神经元数量、SOD和GSH含量、FTH1、SIRT1、Nrf2、GPx4及SLC7A11蛋白表达均升高(P<0.05);采用SIRT1抑制剂进行回补实验,结果显示SIRT1抑制剂逆转了双路通脑方对神经元铁死亡的抑制作用,同时也抑制了Nrf2和GPx4的表达(P<0.05)。结论双路通脑方可能通过激活SIRT1/Nrf2/GPx4信号通路来抑制缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡。

基于Nrf2/GPX4铁死亡途径探讨加味桃仁承气汤对机械通气相关性肺损伤大鼠的保护作用

目的基于核因子E_(2)相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)铁死亡途径探讨加味桃仁承气汤对机械通气相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)大鼠的保护作用。方法将大鼠随机分为对照组、模型组、加味桃仁承气汤组、ML385(Nrf2抑制剂)组、加味桃仁承气汤+ML385组,每组12只。对照组大鼠进行气管插管,但自主呼吸;其他组大鼠均需进行机械通气4 h。机械通气前7 d进行给药处理,每日1次,连续7 d。机械通气结束后,ELISA法检测肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平;检测大鼠肺组织湿质量/干质量比值变化;检测肺组织病理;试剂盒检测大鼠肺组织中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、Fe2+含量;免疫荧光染色法检测肺组织中活性氧(ROS)、4-羟基壬烯醛(4-HNE)相对荧光强度;检测肺组织中质载体家族7成员11(SLC7A11)、Nrf2、GPX4 mRNA及蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠肺组织破坏明显,BALF中TNF-α、IL-6水平升高,肺组织湿质量/干质量比值、MDA、Fe2+含量及ROS、4-HNE相对荧光强度升高,GSH含量、Nrf2、SLC7A11、GPX4 mRNA及蛋白表达降低(P<0.01)。与模型组比较,加味桃仁承气汤组大鼠肺组织病理损伤有所改善,BALF中TNF-α、IL-6水平降低,肺组织湿质量/干质量比值、MDA、Fe^(2+)含量及ROS、4-HNE相对荧光强度降低,GSH含量、Nrf2、SLC7A11、GPX4 mRNA及蛋白表达升高(P<0.01);ML385组对应指标变化趋势与上述相反(P<0.01);加味桃仁承气汤+ML385组肺组织病理损伤减轻,BALF中TNF-α、IL-6水平降低,肺组织湿质量/干质量比值、MDA、Fe2+含量及ROS、4-HNE相对荧光强度降低,GSH含量、Nrf2、SLC7A11、GPX4 mRNA及Nrf2、GPX4蛋白表达升高(P<0.01,P<0.05)。与ML385组比较,加味桃仁承气汤+ML385组肺组织病理损伤有所缓解,BALF中TNF-α、IL-6水平降低,肺组织湿质量/干质量比值、MDA、Fe2+含量及ROS、4-HNE相对荧光强度降低,GSH含量、Nrf2、SLC7A11、GPX4 mRNA及蛋白表达升高(P<0.01)。与加味桃仁承气汤组比较,加味桃仁承气汤+ML385组大鼠肺组织病理损伤加剧,BALF中TNF-α、IL-6水平升高,肺组织湿质量/干质量比值、MDA、Fe2+含量及ROS、4-HNE相对荧光强度升高,GSH含量、Nrf2、SLC7A11、GPX4 mRNA及蛋白表达降低(P<0.01)。结论加味桃仁承气汤可能通过激活Nrf2/GPX4通路抑制铁死亡进而改善大鼠VILI。

Keap1/Nrf2/HO-1/GPX4信号通路阻断癫痫大鼠海马神经元铁死亡机制及草果知母汤的干预效应

目的 探讨Kelch-样ECH相关蛋白1(Keap1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路阻断癫痫海马神经元铁死亡机制及草果知母汤的干预效应。方法 将60只大鼠随机分成正常对照组、模型组、草果知母汤低、中、高剂量组和西药对照组,每组10只。采用腹腔注射戊四氮(PTZ)法建立癫痫大鼠模型,草果知母汤低、中、高剂量组分别给予草果知母汤1.25 g/kg、2.50 g/kg、5.00 g/kg,西药对照组腹腔注射丙戊酸钠(200 mg/kg),连续给药5周,对大鼠进行Racine评分,使用酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒测定海马组织谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)及铁含量,苏木精-伊红(HE)及尼氏(Nissl)染色法观察海马组织病理学变化并计算海马神经元细胞数,免疫组化检测海马组织CA1区GPX4、Nrf2蛋白表达积分光密度(IOD),实时荧光定量聚合酶链式反应(RTq-PCR)及免疫印迹法(Western Blot)检测海马组织Keap1、GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果 与正常对照组比较,模型组大鼠Racine评分、海马组织铁含量及ROS水平、海马组织Keap1 mRNA及蛋白水平均升高(P<0.05),海马组织GSH水平、海马神经元细胞数、海马组织GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA及蛋白表达水平、海马CA1区GPX4、Nrf2蛋白免疫组化积分光密度降低(P<0.05)。与模型组比较,草果知母汤低、中、高各剂量及西药对照组大鼠Racine评分、海马组织铁含量及ROS水平、海马组织Keap1 mRNA及蛋白水平降低(P<0.05),海马组织GSH水平、海马神经元细胞数、海马组织GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平及蛋白表达水平、海马CA1区GPX4、Nrf2蛋白表达积分光密度升高(P<0.05)。结论 草果知母汤能够修复癫痫大鼠海马组织神经元氧化损伤,其机制可能与调节Keap1/Nrf2/HO-1/GPX4通路进而阻断海马神经元铁死亡有关。

淫羊藿苷调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的影响

目的:探讨淫羊藿苷调节核转录E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体蛋白7家族成员11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)通路对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的影响。方法:将小胶质细胞(BV2)分为对照组(5.5 mmol·L^(-1)葡萄糖)、高糖组(35 mmol·L^(-1)葡萄糖)、淫羊藿苷低(35 mmol·L^(-1)葡萄糖+0.37μmol·L^(-1)淫羊藿苷)、高(35 mmol·L^(-1)葡萄糖+1.48μmol·L^(-1)淫羊藿苷)剂量组、抑制剂组(35 mmol·L^(-1)葡萄糖+1.48μmol·L^(-1)淫羊藿苷+1μmol·L^(-1)的Nrf2抑制剂ML385)。采用CCK-8法检测细胞增殖,进行细胞形态学观察,用超氧化物阴离子荧光探针(DHE)、氟硼二吡咯(BODIPYTM)检测细胞内活性氧(ROS)、脂质过氧化(LPO)水平,特异性荧光探针检测细胞内活性铁含量,Western Blot检测细胞Nrf2、SLC7A11、GPX4、血红素加氧酶1(HO-1)、环氧合酶2(COX2)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)蛋白的表达。结果:与对照组比较,高糖组的BV2细胞形态不规则,出现细胞碎片,细胞光密度(OD450)值、Nrf2、SLC7A11、GPX4、HO-1表达明显降低(P<0.05),ROS和LPO水平、活性铁含量、COX2、ACSL4表达显著升高(P<0.05);与高糖组比较,低、高剂量淫羊藿苷组的BV2细胞损伤减少,细胞OD450值、Nrf2、SLC7A11、GPX4、HO-1表达升高(P<0.05),ROS和LPO水平、活性铁含量、COX2、ACSL4表达降低(P<0.05);与高剂量淫羊藿苷组比较,抑制剂组减弱了淫羊藿苷对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的抑制作用。结论:淫羊藿苷通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4通路从而抑制高糖诱导的小胶质细胞铁死亡。

铁死亡相关调控信号通路在非酒精性脂肪肝中的研究进展

非酒精性脂肪肝是一种慢性肝病,随着高血压、肥胖、高脂血症、糖尿病的发生其发病率呈逐年递增趋势。铁死亡是一种新型的非凋亡形式受调控细胞死亡,其特征是脂质过氧化物的大量积累,引发多种疾病,以铁死亡的角度去研究疾病的治疗靶点可以为疾病的治疗提供新的临床解决方案。近年来研究发现,铁死亡相关调控信号通路在非酒精性脂肪肝的发生、发展过程中有重要意义,其中核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)均为常见的铁死亡相关信号通路。现就上述相关信号通路与非酒精性脂肪肝的研究进展进行梳理,为非酒精性脂肪肝的治疗提供指导。

核因子红细胞系2相关因子2抑制铁死亡对高氧肺损伤的影响

目的观察不同条件下人肺微血管内皮细胞(HPMEC)中核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达变化, 探讨Nrf2抑制铁死亡在减轻高氧肺损伤(HLI)过程中的作用。方法采用HPMEC建立高氧暴露模型。将HPMEC按照简单随机分组分为4组:对照组、高氧组(氧体积分数950 mL/L)、铁死亡抑制剂组(氧体积分数950 mL/L, 10 μmol/L Ferrostatin)及Nrf2抑制剂组(氧体积分数950 mL/L, 10 μmol/L ML385), 分别在24 h、48 h使用细胞活性检测试剂盒测定细胞活性, 荧光活性氧(ROS)试剂盒检测各组细胞内ROS水平, 应用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测Nrf2、GPX4的mRNA及其蛋白表达水平。2组间比较采用两样本t检验;多组间比较采用单因素方差分析。结果 1.与对照组相比, 高氧组HPMEC细胞活性降低, 细胞内ROS含量增加, 24 h及48 h GPX4 mRNA(24 h:0.750±0.010比1.010±0.160, 48 h:0.690±0.050比1.000±0.070)和蛋白表达(24 h:0.160±0.010比0.290±0.010, 48 h:0.190±0.010比0.250±0.010)均下降, Nrf2 mRNA(24 h:1.740±0.050比1.000±0.050, 48 h:2.130±0.020比1.000±0.030)和蛋白表达(24 h:0.840±0.010比0.480±0.010, 48 h:0.840±0.010比0.550±0.030)均增加, 差异均有统计学意义(均P<0.05);2.与高氧组相比, 铁死亡抑制剂组细胞活性增加, 细胞内ROS含量减少, 24 h及48 h GPX4 mRNA(24 h:1.520±0.110, 48 h:1.880±0.050)和蛋白表达(24 h:0.290±0.010, 48 h:0.250±0.004)均增加, Nrf2 mRNA(24 h:0.780±0.040, 48 h:0.760±0.030)和蛋白表达(24 h:0.480±0.010, 48 h:0.540±0.020)均下降, 差异均有统计学意义(均P<0.05);3.与高氧组相比, Nrf2抑制剂组细胞活性进一步下降, 细胞内ROS水平进一步增加, 24 h及48 h GPX4 mRNA(24 h:0.600±0.030, 48 h:0.590±0.003)及蛋白表达(24 h:0.150±0.001, 48 h:0.180±0.001)均下降, Nrf2 mRNA表达量在24 h表达升高(3.360±0.130), 48 h表达下降(1.430±0.130), 差异均有统计学意义(均P<0.05), Nrf2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论铁死亡参与了HLI的发生, Nrf2可以通过抑制铁死亡, 从而减轻高氧暴露引起的HLI。因此, Nrf2抑制铁死亡对于HLI的改善作用可以为相关疾病提供新的治疗靶点。

丹酚酸B基于Nrf2-Gpx4通路介导的铁死亡途径改善单侧输尿管梗阻大鼠肾脏间质纤维化

目的基于核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)-谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,Gpx4)通路介导的铁死亡途径,探究丹酚酸B对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠肾脏间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)的改善作用。方法采用随机数字表法将40只大鼠分为假手术组、模型组、丹酚酸B组、丹酚酸B+Nrf2抑制剂组,每组10只。除假手术组外,其余各组建立UUO模型,假手术组除不结扎、剪断输尿管外,其余操作相同。丹酚酸B组灌胃100 mg·kg^(-1)·d^(-1)丹酚酸B,丹酚酸B+Nrf2抑制剂组在丹酚酸B组基础上腹腔注射Nrf2抑制剂ML38530 mg·kg^(-1)·d^(-1),假手术组、模型组灌胃等体积无菌生理盐水,连续9 d。HE染色和Masson染色检测肾组织形态和纤维化情况;试剂盒检测肾脏组织中Fe^(2+)、丙二醛(maleicdialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹检测肾脏组织中Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ,CoL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Collagen-Ⅲ,CoL-Ⅲ)、Nrf2、Gpx4的mRNA和蛋白水平。结果与假手术组相比,模型组肾脏组织中Fe^(2+)、MDA含量,CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ的mRNA和蛋白水平升高(P<0.05),血清中SOD活性降低(P<0.05),肾脏组织中Nrf2、Gpx4的mRNA和蛋白水平降低(P<0.05);与模型组相比,丹酚酸B组肾脏组织中Fe^(2+)、MDA含量,CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ的mRNA和蛋白水平降低(P<0.05),血清中SOD活性,肾脏组织中Nrf2、Gpx4的mRNA和蛋白水平升高(P<0.05);与丹酚酸B组相比,丹酚酸B+Nrf2抑制剂组肾脏组织中Fe^(2+)、MDA含量,CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ的mRNA和蛋白水平升高(P<0.05),血清中SOD活性,肾脏组织中Nrf2、Gpx4的mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)。结论丹酚酸B能够激活Nrf2-Gpx4通路进而抑制铁死亡实现对UUO大鼠RIF的缓解。

基于Nrf2/HO-1/GPX4信号通路探讨真武汤改善脾肾阳虚型糖尿病肾病小鼠的作用机制

目的:基于核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路探讨真武汤对脾肾阳虚型糖尿病肾病(DKD)小鼠肾脏氧化损伤的干预作用及机制。方法:将25只7周龄SPF级雄性db/m小鼠及95只7周龄SPF级雄性db/db小鼠适应性喂养1周。db/m小鼠作为空白组,其余小鼠进行运用灌服生大黄溶液和氢化可的松制备脾肾阳虚型DKD模型,成模后随机分为模型组、厄贝沙坦组(25 mg·kg^(-1))、真武汤高、中、低剂量(33.8、16.9、8.45 g·kg^(-1))组,每组15只,连续灌胃8周。观察小鼠生存状态和计算中医证候评分并测定脾肾阳虚相关、空腹血糖(FBG)及肾功能相关指标;苏木素-伊红(HE)染色观察各组肾脏组织病理学改变;生化试剂盒法测定肾组织中氧化应激相关指标;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、GPX4 m RNA和蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组小鼠中医证候积分明显升高(P<0.05),雌二醇(E2)含量明显升高(P<0.05),睾酮(T)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)含量明显降低(P<0.05);FBG明显升高(P<0.05),肾功能明显下降(P<0.05);肾脏病理显示肾小球肥大,肾小球系膜和基底增厚明显,肾组织中过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)、还原型谷胱甘肽(GSH)水平均明显降低(P<0.05),丙二醛(MDA)的含量明显升高(P<0.05),肾组织中Nrf2、HO-1、GCLC、GPX4 m RNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.05);与模型组比较,真武汤高、中剂量组中医证候积分明显降低、E2含量明显降低(P<0.05),T、T3、T4含量明显升高(P<0.05);肾功能明显改善(P<0.05),肾脏病理明显改善,真武汤高、中剂量组小鼠肾组织中CAT、T-AOC、GSH水平均明显升高(P<0.05),MDA的含量明显下降(P<0.05),各给药组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1、GCLC、GPX4 m RNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:真武汤改善脾肾阳虚型db/db小鼠一般状态、肾功能,降低氧化损伤和减轻肾脏病理改变,其作用机制可能与调节Nrf2/HO-1/GPX4通路有关。

补中益气汤通过调节Nrf2/PPARγ/GPX4通路抑制铁死亡改善自身免疫性甲状腺炎小鼠甲状腺损伤

目的:基于核因子E2相关性因子2(Nrf2)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)/谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)通路探讨补中益气汤改善自身免疫性甲状腺炎(AIT)小鼠铁死亡的作用机制。方法:将120只SPF级8周龄NOD.H-2h4小鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、补中益气汤低、中、高剂量组及西药组,各20只,除空白组外,采用经典的高碘水(0.05%碘化钠)喂养,8周后制成AIT模型。补中益气汤低、中、高剂量组分别予4.78、9.56、19.12 g·kg^(-1)补中益气汤灌胃,西药组给予3.033×10^(-5) g·kg^(-1)硒酵母片混悬液灌胃,空白组及模型组给予等体积蒸馏水灌胃,连续8周后实施取材。苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠甲状腺组织病理形态;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)含量;试剂盒检测小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;采用免疫荧光检测甲状腺组织中GPX4定位表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)检测甲状腺组织Nrf2、PPARγ、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、溶质载体家族3成员2(SLC3A2)、溶血卵磷脂酰基转移酶3(LPCAT3)、GPX4 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测甲状腺组织Nrf2、PPARγ、SLC7A11、SLC3A2、LPCAT3、GPX4蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组小鼠光镜下可见甲状腺组织内明显的淋巴细胞浸润现象,血清中TGAb、TPOAb含量显著升高(P<0.01),MDA水平显著升高,SOD水平显著降低(P<0.01);甲状腺组织中Nrf2、PPARγ、SLC7A11、SLC3A2、GPX4表达显著降低(P<0.01),LPCAT3的表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,补中益气汤各剂量组及西药组小鼠光镜下甲状腺组织内的淋巴细胞浸润程度减轻,血清中TPOAb、TGAb含量明显降低(P<0.05,P<0.01),MDA水平明显降低、SOD水平明显升高(P<0.05,P<0.01);甲状腺组织中Nrf2、PPARγ、SLC7A11、SLC3A2、GPX4表达明显升高、LPCAT3的表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。与西药组比较,补中益气汤各剂量组甲状腺组织中Nrf2、PPARγ、SLC7A11、SLC3A2、GPX4、LPCAT3表达总体趋势差异明显(P<0.05,P<0.01)。结论:补中益气汤可有效改善AIT的炎症损伤,其作用机制可能与调控Nrf2/PPARγ/GPX4抑制铁死亡进程有关。

血管软化丸调控Nrf2/xCT/GPX4通路抑制血管内皮细胞铁死亡改善动脉粥样硬化的作用机制

目的 从核因子E2相关因子2(Nrf2)/胱氨酸谷氨酸反向转运蛋白(xCT)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)通路探讨血管软化丸对ApoE^(-/-)动脉粥样硬化(AS)小鼠铁死亡的作用及分子机制。方法 10只普通饲料喂养C57BL/6J雄性小鼠为正常组。ApoE^(-/-)小鼠高脂饲料喂养12周构建AS动物模型,按随机数字表法将50只造模成功的小鼠分为模型组、血管软化丸低剂量(2.34 g/kg)组、血管软化丸高剂量(4.68 g/kg)组、血管软化丸高剂量+ML385(0.03 g/kg)组、铁死亡抑制剂(1 mg/kg)组,每组10只,连续干预6周。采用全自动血脂分析仪检测血脂水平[甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)],油红O染色观察主动脉脂质沉积情况,苏木素-伊红(HE)染色观察主动脉窦组织形态学变化,比色法检测各组小鼠血清中Fe^(2+)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,免疫荧光观察各组小鼠主动脉窦铁蛋白重链(FTH1)和铁蛋白轻链(FTL)蛋白表达,蛋白质印迹法检测小鼠主动脉组织Nrf2、xCT、GPX4蛋白水平,透射电镜观察主动脉线粒体超微结构改变。结果 与正常组比较,模型组小鼠主动脉可见明显脂质斑块沉积、主动脉窦钙化病变严重,血清TC、TG、LDL-C、Fe^(2+)、MDA水平均升高,HDL-C、SOD、GSH水平下降(P<0.01),主动脉组织Nrf2、xCT、GPX4蛋白及铁储存蛋白FTH1、FTL表达下降(P<0.01),线粒体结构形态损伤严重;与模型组比较,血管软化丸低、高剂量组及铁死亡抑制剂组小鼠治疗后主动脉斑块面积占比下降、主动脉窦钙化病变减轻,血清TC、TG、LDL-C、Fe^(2+)、MDA水平下降,HDL-C、SOD、GSH水平升高,差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.01),主动脉组织Nrf2、xCT、GPX4蛋白及铁储存蛋白FTH1、FTL阳性表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),线粒体结构趋近正常;与血管软化丸高剂量组比较,血管软化丸高剂量+ML385组小鼠血脂及脂质过氧化水平有所增加,主动脉组织Nrf2、xCT、GPX4蛋白及铁储存蛋白FTH1、FTL阳性表达下降(P<0.01),线粒体结构损伤,可逆转血管软化丸对AS小鼠的治疗作用。结论 血管软化丸可改善AS小鼠血脂水平、减少动脉斑块病变程度,其作用机制可能与激活Nrf2/xCT/GPX4通路、抑制铁死亡有关。

温肺降浊方通过调节Nrf2/Keap 1-GPx4信号通路抑制铁死亡改善血管性痴呆模型大鼠认知功能障碍的研究

目的:观察温肺降浊方对血管性痴呆模型大鼠的影响,探究其可能的作用机制。方法:制备永久性双侧颈总动脉闭塞(2VO)大鼠模型,使用Ferrostatin-1抑制剂和温肺降浊方2.95、5.9、11.8 g/kg干预,持续2个月。观察成模后大鼠学习认知能力,HE染色观察海马病理情况,普鲁士蓝染色、免疫组化、qRT-PCR和Western Blot法检测大鼠海马组织中铁沉积和GPx4、Nrf2、HO-1、Keap 1、Cox2 mRNA及蛋白的表达情况。结果:与假手术对照组比较,模型对照组大鼠逃避潜伏期延长、穿越平台次数明显缩短(P<0.05),海马细胞出现明显水肿及棕蓝色铁颗粒沉积;海马组织中GPx4、Nrf2、HO-1蛋白及mRNA的表达下调(P<0.05),Keap 1、Cox2蛋白及mRNA的表达上调(P<0.05);与模型对照组比较,Ferrostatin-1抑制剂和温肺降浊方各剂量组大鼠逃避潜伏期缩短、穿越平台次数明显增加(P<0.05),海马组织细胞水肿化减少;GPx4、Nrf2、HO-1蛋白及mRNA的表达上调(P<0.05),Keap 1、Cox2蛋白及mRNA的表达下调(P<0.05)。结论:温肺降浊方可能通过调节Nrf2/Keap 1/GPx4信号通路相关蛋白抑制铁死亡,从而减少大脑海马组织中铁颗粒的沉积,从而改善大脑认知情况,以温肺降浊方11.8 g/kg组作用最佳。

补肾通蚀丸通过调控Nrf2/SLC7A11/GPX4通路介导铁死亡对酒精性股骨头坏死大鼠成骨功能障碍的影响

目的:探讨补肾通蚀丸通过抑制成骨细胞铁死亡促进酒精性股骨头坏死(AIONFH)大鼠股骨头修复的机制。方法:雄性SD大鼠36只,随机分为对照组、模型组、治疗组(补肾通蚀丸1.2 g/kg),每组12只,使用Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂养制备AIONFH大鼠模型。Micro-CT扫描测量相关骨组织学分数;肉眼观察股骨头大体形态;HE染色观察股骨头组织病理形态学;生化试剂盒检测血清与股骨头组织中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、总铁离子浓度水平;RT-qPCR、Western Blot分别检测核红系转录因子2(Nrf2)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen-Ⅰ)mRNA和蛋白表达量。结果:与模型组比较,治疗组大鼠股骨头骨质丢失情况减轻(P<0.05),股骨头组织病理学改变减轻,血清与股骨头组织中MDA、总铁离子浓度水平显著降低(P<0.05),GSH水平显著升高(P<0.05),Nrf2、SLC7A11、GPX4、ALP、OCN、Collagen-ⅠmRNA和蛋白相对表达量显著增加(P<0.05)。结论:补肾通蚀丸可能通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4通路抑制成骨细胞铁死亡,促进AIONFH大鼠股骨头成骨修复能力。

藜芦胺对人胶质母细胞瘤细胞U251增殖的影响及机制

目的 探究藜芦胺(VTM)对人胶质母细胞瘤(GBM)细胞U251增殖的影响及其潜在机制。方法 借助网络药理学方法,筛选VTM干预GBM的铁死亡相关交集靶点,并进行基因本体、京都基因和基因组百科全书富集分析。以U251细胞为对象,采用CCK-8法、细胞克隆形成实验、细胞形态变化观察、2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针法、FerroOrange荧光探针法、Western blot实验对VTM抑制U251细胞增殖的作用及可能机制进行验证。结果 共筛选出VTM干预GBM的铁死亡相关交集靶点462个,富集于氧化应激、细胞凋亡等生物学过程,胞质囊泡、线粒体膜等细胞成分,影响二价铁离子(Fe^(2+))结合、DNA转录过程等分子功能,以及铁死亡、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路等。40、60、80、100、120、140μmol/L的VTM均可显著降低细胞存活率(P<0.01);40、80、120μmol/L的VTM可使细胞萎缩、细胞核破碎,可显著抑制其克隆形成,显著提高其活性氧(ROS)、Fe^(2+)水平,并可不同程度地上调核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)蛋白的表达,下调谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。结论 VTM可抑制U251细胞的增殖,促进细胞内ROS和Fe^(2+)的蓄积,从而诱导铁死亡,上述作用可能与调控Nrf2/HO-1/GPX4信号通路有关。

骨骼疾病中的铁死亡:骨质疏松治疗靶点

背景:随着全球人口的老龄化加剧,骨质疏松症的发病率不断增加,了解其发病机制和提出治疗相关的新靶点显得至关重要。最近的研究表明,铁死亡与一些骨骼疾病的发病机制密切相关,例如炎性关节炎、骨质疏松症和骨关节炎等。目的:通过总结既往关于骨质疏松中铁死亡机制的研究,为骨质疏松提供新的治疗思路和潜在的治疗靶点。方法:由第一作者应用计算机检索2000-2022年出版的文献,以“铁死亡,骨质疏松,成骨细胞,破骨细胞,铁螯合剂,活性氧,核因子红系2相关因子2,Nrf2,血红素加氧酶1,HO-1,谷胱甘肽过氧化物酶4,GPX4”等为中文检索词检索中国知网、万方和维普数据库;以“ferroptosis,osteoporosis,osteoblasts,osteoclasts,iron chelators,reactive oxygen species,nuclear factor erythroid 2-related factor 2,heme oxygenase-1,glutathione peroxidase 4”等为英文检索词检索PubMed和Web of Science数据库,按照入选标准最终共纳入70篇文献。结果与结论:①铁死亡与坏死、凋亡和自噬明显不同。在细胞形态和功能方面,它不具有典型坏死的形态学特征,它也不具有传统细胞凋亡的特征,如细胞收缩、染色质凝结、凋亡小体的形成和细胞骨架的解体。与自噬相反,铁死亡没有形成经典的封闭双层膜结构(自噬液泡)。形态学上,铁死亡主要表现为线粒体明显收缩,膜密度增加,线粒体嵴减少或消失,这与其他细胞死亡模式不同。②铁超载可通过显著抑制成骨分化和刺激破骨细胞生成来破坏骨稳态,从而导致骨质疏松。铁超载干扰干细胞向成骨细胞的分化,导致成骨细胞功能减弱,体内骨代谢进一步失衡,从而导致骨质疏松;在铁超载的刺激下,破骨细胞骨吸收增强,骨丢失超过新骨的形成。③铁螯合剂被证明通过抑制破骨细胞活性和刺激成骨细胞的成骨分化而具有骨保护作用,其潜在机制与抑制破骨细胞分化和促进成骨细胞分化有关;④抗氧化剂可以防止更多的活性氧产生,抑制骨吸收,从而改善骨代谢,有效预防骨质疏松症的发生。

NRF2信号通路在三氯乙烯致HepG2细胞氧化应激中的作用

目的探讨三氯乙烯(TCE)致人肝癌细胞系HepG2细胞氧化应激中核因子E2相关因子2(NRF2)信号通路的作用。方法取对数生长期HepG2细胞随机分为对照组和低、中、高剂量组,分别以终浓度为0、2、4、8 mmol/L的TCE刺激24 h后,收集细胞,采用2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力,酶促法检测过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)水平,酶联免疫吸附法检测8-羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)水平,实时荧光聚合酶链式反应法检测NRF2、血红素加氧酶-1(HO1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和醌氧化还原酶1(NQO1)的mRNA表达,蛋白免疫印迹法检测NRF2、HO1、GCLC和NQO1蛋白的表达。结果与对照组比较,3个剂量组HepG2细胞CAT活力均下降(P值均<0.05),GSH-Px活力均升高(P值均<0.05);低剂量组HepG2细胞MDA水平下降(P<0.05)。4组HepG2细胞SOD活力和8-OHDG水平分别比较,差异均无统计学意义(P值均>0.05)。与对照组比较,低、中剂量组HepG2细胞NRF2、GCLC的mRNA和蛋白相对表达水平均下降(P值均<0.05),HO1 mRNA相对表达水平均下降(P值均<0.05)。与对照组比较,低剂量组HepG2细胞HO1蛋白相对表达水平升高(P<0.05),NQO1的mRNA和蛋白相对表达水平均升高(P值均<0.05)。中剂量组HepG2细胞HO1蛋白相对表达水平低于对照组(P<0.05)。与其余3组比较,高剂量组HepG2细胞NRF2和NQO1的mRNA和蛋白相对表达水平均升高(P值均<0.05),HO1 mRNA相对表达水平均升高(P值均<0.05)。结论低、中剂量TCE刺激可导致HepG2细胞发生氧化应激,抗氧化物酶活力降低;高剂量TCE刺激HepG2细胞可激活NRF2信号通路,调控下游抗氧化物酶HO1、GCLC、NQO1的表达上调,缓解TCE所致的氧化损伤。

三七皂苷R_(1)调控Nrf2介导的铁死亡途径改善ApoE^(−/−)小鼠动脉粥样硬化

目的探究三七皂苷R_(1)对高脂诱发的载脂蛋白E基因敲除(ApoE^(−/−))小鼠动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的治疗作用及机制。方法高脂喂养雄性ApoE^(−/−)小鼠12周建立AS模型,将其随机分为模型组及三七皂苷R_(1)低、高剂量(25、35 mg/kg)组和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1,1 mg/kg)组。以相同周龄的雄性C57BL/6J小鼠作为对照组,给予普通饲料饲养。给药5周后采用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglycerides,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平;苏木素-伊红(HE)染色和油红O染色观察主动脉粥样斑块程度;加强普鲁士蓝染色法评估斑块铁沉积;生化试剂盒检测主动脉超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活力及谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;免疫组化法检测主动脉4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)表达;Western blotting检测主动脉核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)及4-HNE蛋白表达;qRT-PCR法检测主动脉Nrf2、Gpx4、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2)mRNA表达。结果三七皂苷R_(1)低、高剂量组及Fer-1组不同程度地影响ApoE^(−/−)小鼠的血脂水平(P<0.05、0.01),明显减轻主动脉粥样斑块程度,抑制铁沉积(P<0.01),提高SOD、GSH抗氧化能力(P<0.05、0.01),减少脂质过氧化MDA水平和4-HNE蛋白表达(P<0.05、0.01),上调铁死亡相关核Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白及Nrf2、Gpx4 mRNA的表达(P<0.01),下调Ptgs2 mRNA的表达(P<0.01),以三七皂苷R_(1)高剂量组效果最为显著。结论三七皂苷R_(1)改善ApoE^(−/−)小鼠脂代谢紊乱,抑制动脉粥样斑块形成,具有抗AS的作用,其机制可能与减少斑块铁沉积、激活Nrf2/SLC7A11/GPX4通路减少脂质过氧化,抑制铁死亡有关。

膝痹宁Ⅱ方对膝骨关节炎软骨细胞铁死亡及Nrf2/GPX4信号通路的影响

目的:探究膝痹宁Ⅱ方对膝骨关节炎(KOA)原代小鼠关节软骨细胞(PMCs)铁死亡的影响及其保护机制。方法:使用叔丁基过氧化氢(TBHP)诱导PMCs铁死亡模型,随机分为对照组,模型组和膝痹宁Ⅱ低、中、高剂量组。采用CCK-8法和EDU染色检测细胞活力;流式细胞术检测活性氧(ROS)水平;FerroOrange染色检测Fe^(2+)水平;试剂盒检测铁含量、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平,BODIPY 581/591 C11染色检测脂质过氧化水平;JC-1染色检测线粒体膜电位水平;Western Blot和qRT-PCR检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)蛋白和mRNA表达水平。结果:与模型组比较,膝痹宁Ⅱ方各剂量组可显著增加PMCs细胞存活率,抑制ROS水平升高,降低Fe^(2+)、MDA水平和铁含量,升高SOD、GSH水平,减少脂质过氧化损伤,恢复线粒体膜电位,上调Nrf2、GPX4和SLC7A11表达,下调ACSL4表达,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论:膝痹宁Ⅱ方在体外可能通过激活Nrf2/GPX4信号通路发挥抗氧化作用,实现抑制KOA小鼠PMCs铁死亡的作用。

罗哌卡因对人结肠癌顺铂耐药细胞株顺铂敏感性的增强作用及其机制

目的观察罗哌卡因对人结肠癌顺铂耐药细胞株顺铂敏感性的增强作用,并进一步探讨其作用机制。方法通过浓度递增法将人结肠癌LOVO细胞暴露于顺铂中诱导顺铂耐药株LOVO/DDP形成。将LOVO和LOVO/DDP两种结肠癌细胞株分别分为罗哌卡因联合顺铂组、罗哌卡因组、顺铂组、对照组。对照组加入细胞培养液,顺铂组加入细胞培养液和1.0μmol/L浓度顺铂,罗哌卡因联合顺铂组加入细胞培养液后再同时加入1.0μmol/L浓度顺铂及1 mmol/L浓度罗哌卡因培养。培养14 d,采用平板克隆实验观察细胞增殖能力。培养48 h后,采用Tran⁃swell和流式细胞术观察细胞迁移、凋亡情况;JC-1和ROS实验测定细胞线粒体膜电位和活性氧(ROS);Western blot⁃ting法、免疫荧光法检测细胞株中MMP-9及铁死亡相关蛋白GPX4、Nrf-2、SLC7A11;亚铁离子染色法检测结肠癌细胞株中亚铁离子。结果LOVO细胞中,与对照组比较,顺铂组LOVO细胞株克隆体的形成减少、迁移细胞株数减少、MMP-9蛋白水平降低、凋亡率升高、存活率降低,罗哌卡因组克隆体形成数、迁移细胞株数、MMP-9蛋白水平、细胞凋亡率、细胞存活率变化不明显,顺铂联合罗哌卡因组细胞株克隆体数减少、迁移细胞数减少、MMP-9蛋白水平下降、凋亡率升高、存活率降低(P均<0.05);与顺铂组比较,顺铂联合罗哌卡因组细胞株克隆体数少、迁移细胞数少、MMP-9蛋白水平低、凋亡率高、存活率低(P均<0.05)。在LOVO/DDP细胞株中,与对照组比较,顺铂组、罗哌卡因组细胞株克隆体数、迁移细胞株数、MMP-9蛋白水平变化不明显,顺铂联合罗哌卡因组细胞株克隆体数、迁移细胞株数减少、MMP-9蛋白水平降低、细胞凋亡率降低、细胞存活率升高(P均<0.05)。在LOVO细胞株和LOVO/DDP细胞株中,与对照组比较,其他三组JC-1多聚体红色荧光与单体绿色荧光比值[JC-1(Red/Green)]均降低,ROS水平升高,GPX4蛋白水平下降,GPX4相对荧光强度减弱,Fe2+荧光强度增强,以罗哌卡因联合顺铂组最显著(P均<0.01)。在LOVO/DDP细胞株中,与对照组相比,顺铂组及罗哌卡因组Nrf-2、SLC7A11蛋白表达水平无明显变化(P均>0.05),罗哌卡因联合顺铂组Nrf-2、SLC7A11蛋白水平均下降(P均<0.01)。结论罗哌卡因可增强人结肠癌顺铂耐药细胞株顺铂敏感性,其作用机制可能与由Nrf-2、GPX4、SLC7A11及线粒体膜电位水平降低、ROS水平升高诱导的铁死亡有关。

细胞铁死亡发生机制的研究进展

铁死亡是一种全新的细胞死亡方式,具有独特的形态结构、生物化学及遗传学表现,其本质是铁离子依赖的脂质过氧化产物超量蓄积引起的以线粒体改变为主的氧化损伤。铁离子代谢失衡,诱发机体大量活性氧类与脂质过氧化物的产生,导致细胞铁死亡;而核转录因子红系2相关因子2/谷胱甘肽过氧化物酶4抑制氧化应激是铁死亡的关键信号通路;胱氨酸/谷氨酸反向转运体促进谷胱甘肽的合成;电压依赖性阴离子通道稳定线粒体代谢及离子平衡;p53上调溶质载体家族7成员11的表达,抑制胱氨酸进入细胞内,促进铁死亡。铁死亡与肿瘤、神经退行性疾病、缺血再灌注损伤等有关,但铁离子在细胞铁死亡中的具体作用以及铁死亡与其他细胞死亡方式之间是否存在潜在的相关性需进一步探讨。

红景天苷混悬液灌胃对小鼠急性放射性肺损伤的改善作用及其作用机制

目的观察红景天苷(SAL)混悬液灌胃对小鼠急性放射性肺损伤(RILI)的改善作用,探讨其可能作用机制。方法将48只C57BL/6J雄性小鼠随机分为低剂量组、中剂量组、高剂量组、地塞米松(DXM)组、模型组及对照组,每组8只。除对照组外,其余五组小鼠用医用直线加速器6 MV-X线行全胸单次照射,在照射后第2天低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠分别予15、30、60 mg/kg的SAL混悬液灌胃(1次/天,连续7 d),DXM组小鼠予10 mg/kg的DXM灌胃(1次/天,连续7 d),对照组和模型组小鼠予等体积生理盐水灌胃(1次/天,连续7 d)。灌胃结束后第2天,抽取各组小鼠外周静脉血,处死小鼠后留取肺组织。HE染色后观察各组小鼠肺组织形态学变化;采用ELISA法检测小鼠血清炎性因子[白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)];采用实时荧光定量PCR法检测小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA;采用Western Blotting法检测小鼠肺组织核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、转化生长因子β(TGF-β)。结果低、中、高剂量组小鼠肺组织损伤均有不同程度的改善,高剂量组小鼠肺组织损伤改善程度最明显;与高剂量组相比,DXM组小鼠肺组织损伤改善更明显;与对照组相比,模型组小鼠肺组织肺泡间隔弥漫增厚、水肿,肺泡腔明显缩小甚至消失,正常结构明显破坏。与对照组相比,模型组小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P均<0.05);与模型组相比,中、高剂量组和DXM组小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低(P均<0.05)。与模型组相比,中、高剂量组和DXM组小鼠肺组织IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相对表达量低(P均<0.05)。与对照组相比,模型组小鼠肺组织Nrf2、HO-1和GPX4表达升高,TGF-β表达降低(P均<0.05);与模型组相比,中高剂量组和DXM组小鼠肺组织Nrf2、HO-1和GPX4表达升高,TGF-β表达降低(P均<0.05)。结论SAL混悬液灌胃可改善小鼠急性RILI(其中60 mg/kg的SAL混悬液效果最好)。SAL混悬液对小鼠急性RILI的改善作用机制可能是SAL促进肺组织Nrf2、HO-1蛋白表达,减轻小鼠氧化应激和炎症反应。