基于miR-9/NF-κB信号通路探讨丙泊酚对鼻咽癌细胞增殖、凋亡的影响

目的:基于微小RNA-9(miR-9)/核因子-κB(NF-κB)信号通路探讨丙泊酚对鼻咽癌细胞增殖、凋亡的影响。方法:设鼻咽癌细胞(CNE-2Z)采用细胞组、顺铂组(7.5μg·ml^(-1))、丙泊酚低、高剂量组(25,50μg·ml^(-1)),以上各组每孔设6个平行样,培养72 h,培养结束后,采用四唑盐(MTT)法及Giemsa溶液染色测定细胞增殖及克隆形成数目,Transwell腔室系统测定侵袭迁移水平,流式细胞仪测定凋亡水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法及蛋白免疫印迹(WB)法测定miR-9、NF-κB mRNA和蛋白水平。结果:与CNE-2Z细胞组比较,顺铂组、丙泊酚低、高剂量组吸光度(A)值、存活率、克隆形成数目、穿膜数、miR-9、NF-κB mRNA和蛋白水平显著降低,凋亡率显著升高(P<0.05);与顺铂组比较,丙泊酚低、高剂量组A值、存活率、克隆形成数目、穿膜数、miR-9,NF-κB mRNA和蛋白水平显著升高,凋亡率显著降低(P<0.05);丙泊酚剂量组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:丙泊酚可抑制鼻咽癌细胞增殖,促进其凋亡;其机制与丙泊酚抑制miR-9、NF-κB mRNA和蛋白表达进而抑制miR-9/NF-κB信号通路激活有关。

姜黄素调控miR-21对病毒性心肌炎细胞凋亡、炎症反应及NF-κB信号通路的影响

目的:探讨姜黄素(Cur)是否通过调控微小RNA-21(miR-21)影响病毒性心肌炎(VMC)心肌细胞的凋亡及炎症反应。方法:用柯萨奇病毒B3(CVB3)感染心肌细胞建立VMC心肌细胞模型记为CVB3组,未经任何处理的心肌细胞作为对照组。以不同浓度(0.25,0.50,1.00μmol)的Cur处理心肌细胞进行干预,采用流式细胞术检测细胞凋亡率;以酶联免疫吸附法(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)的含量;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Cur对miR-21表达水平的影响;分别将anti-miR-con、anti-miR-21转染至心肌细胞后使用CVB3处理,分别将miR-con、miR-21 mimics转染至心肌细胞后使用Cur与CVB3处理,采用上述方法检测细胞凋亡率及炎性因子的含量;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、核因子-κB(NF-κB)信号通路相关蛋白表达。结果:与对照组比较,CVB3组心肌细胞凋亡率[(6.81±0.60)%与(21.38±1.92)%]升高(P<0.05),miR-21[(1.00±0.05)与(1.84±0.12)]、Cleaved Caspase-3表达水平[(0.31±0.01)与(1.21±0.08)]、TNF-α[(105.44±9.15)ng/mL与(623.10±41.06)ng/mL]、IL-6[(89.01±6.11)pg/mL与(453.67±31.32)pg/mL]、MCP-1[(491.16±38.02)pg/mL与(1803.11±82.01)pg/mL]水平升高(P<0.05),Cur处理后能够逆转CVB3对VMC心肌细胞凋亡、炎性因子水平及NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响;干扰miR-21表达可降低细胞凋亡率及TNF-α、IL-6、MCP-1水平(P<0.05),抑制Cleaved Caspase-3过表达,miR-21能够部分逆转Cur对VMC心肌细胞凋亡、炎症反应及NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。结论:Cur可通过下调miR-21的表达缓解VMC心肌细胞炎症反应而对心肌细胞发挥保护作用,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路活化及心肌细胞凋亡有关。

高血压合并慢性阻塞性肺病患者外周血微小RNA-155与Toll样受体4-核转录因子κB通路的相关性

目的探讨高血压合并慢性阻塞性肺病(COPD)患者外周血微小RNA-155(miR-155)水平与Toll样受体4-核转录因子κB(TLR4-NF-κB)通路的相关性。方法选择2017年10月-2019年10月收治的高血压合并COPD患者200例作为高血压+COPD组,单纯高血压患者200例和单纯COPD患者200例分别设为高血压组和COPD组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组患者外周血单核细胞miR-155表达情况,并采用Western blot检测两组TLR4-NF-κB通路相关蛋白表达情况,分析miR-155与TLR4-NF-κB通路相关蛋白表达的相关性,并采用受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-155对老年高血压合并COPD的诊断价值。结果高血压+COPD组患者外周血miR-155相对表达量高于高血压组和COPD组,且高血压组明显高于COPD组(P<0.05)。高血压+COPD组患者TLR4-NF-κB信号通路相关蛋白TLR4、髓样分化因子(Myd88)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)以及NF-κBp65相对表达量高于高血压组和COPD组,且高血压组明显高于COPD组(P<0.05)。高血压+COPD患者miR-155水平与TLR4(r=0.332)、Myd88(r=0.372)、TRAF6(r=0.286)以及NF-κBp65(r=0.357)蛋白表达水平呈正相关(均P<0.05)。ROC曲线分析显示,外周血miR-155诊断高血压+COPD的ROC曲线下面积为0.903。结论高血压合并COPD患者外周血miR-155表达水平异常升高,其表达异常与患者TLR4-NF-κB信号通路激活有关。

RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用及分子机制

目的探讨重组信号序列结合蛋白J(RBPJ)-微小核糖核酸155(miR155)-核转录因子-κB(NF-κB)-缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)通路在大鼠脑缺血再灌注损伤中的调控作用及分子机制。方法60只成年大鼠随机均分为假手术(sham)组(仅分离并暴露颈部血管,不插线栓)和实验组(采用线栓法建立脑缺血-再灌注损伤模型),采用Longa评分评估术后神经功能损伤;0.3 mL/100 g水合氯醛腹腔麻醉大鼠后断头取脑,分别采用实时荧光定量聚合酶链式反应和免疫印迹法检测2组大鼠脑组织中RBPJ、miR155、HIF-1α及NF-κB mRNA和蛋白的表达,采用双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀测序miR155与HIF-1α、RBPJ及NF-κB的相互作用位点;采用基因沉默技术干扰RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路后,用酶联免疫吸附实验检测2组大鼠脑组织样本中TNF-α、白细胞介素1β(IL-1β)及IL-6相关炎性因子的表达;取新生24 h内SD乳鼠10只,采用75%乙醇浸泡消毒后取脑海马组织消化培养神经元细胞,采用慢病毒转染基因沉默技术在细胞层面验证RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路的相关性。结果与sham组比较,实验组大鼠出现明显的神经功能损伤(P<0.05),脑梗死面积大于sham组(P<0.05);sham组大鼠脑组织中miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB的表达水平均低于实验组(P<0.05);沉默RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效应分子中的1种,该通路中其他分子表达均降低(P<0.05);miR155与HIF-1α之间的结合位点为E-box CANNTG,miR155与NF-κB之间的结合位点为AC-CAAAG,双荧光素酶报告提示miR155与NF-κB3′UTR进行结合;抑制RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路后,TNF-α、IL-1β及IL-6表达下降(P<0.05)。结论RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路在大鼠脑缺血再灌注损伤中起着重要的负性调控作用,其机制可能与该通路相关因子miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB的相互影响和炎症因子的表达有关。

微小RNA-206减轻结肠上皮NCM-460细胞炎症反应的机制研究

目的探究微小RNA(miR)-206对人结肠上皮NCM-460细胞炎症反应及核转录因子(NF)-κB信号通路的调控作用。方法体外培养人结肠上皮NCM-460细胞,根据不同干预手段将其分为Con组、脂多糖(LPS)组、Inhibitor NC+LPS组和miR-206 inhibitor+LPS组,每组3次重复。分别采用实时荧光定量PCR、倒置显微镜、细胞计数试剂盒(CCK)-8、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)、Hoechst 33258染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)及蛋白免疫印迹法(Western blot)对miR-206表达水平、细胞形态、细胞活力、增殖率、凋亡率、炎性细胞因子及相关蛋白表达水平进行分析。结果与Con组比较,LPS组细胞生长受到抑制,细胞活力及增殖率、IL-10、细胞周期蛋白(Cyclin)D1蛋白表达水平均显著降低,而miR-206表达水平、细胞凋亡率、肿瘤坏死因子(TNF)-α、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白表达水平和p-NF-κB p65/NF-κB p65均显著增加;与Inhibitor NC+LPS组相比,miR-206 inhibitor+LPS组细胞生长得到改善,细胞活力、细胞增殖率、IL-10、Cyclin D1蛋白表达水平均显著升高,而miR-206表达水平、细胞凋亡率、TNF-α、Caspase-3蛋白表达水平和p-NF-κB p65/NF-κB p65均显著减少(P<0.05)。结论下调miR-206可减轻人结肠上皮NCM-460细胞的炎症反应,促进细胞增殖并抑制其凋亡,作用机制可能与负调控NF-κB通路的信号转导相关。

miR-623通过调控STAT3/NF-κB信号通路对紫草素诱导膀胱癌细胞上皮间质转化的影响

目的探究微小核糖核酸(miR)-623通过调控转录激活因子(STAT)3/核转录因子(NF)-κB信号通路对紫草素诱导膀胱癌细胞上皮间质转化的影响。方法选取SPF级SD雄性大鼠55只,并进行造模,造期间在膀胱灌注等操作时导致7只死亡,共36只大鼠建模成功,分为模型组、低剂量组和高剂量组各12只。空白组与模型组均给予生理盐水灌胃,不做其他处理,低剂量组在模型组的基础上给予紫草素25 mg/kg(与生理盐水融合)灌胃,高剂量组给予75 mg/kg(与生理盐水融合)灌胃。观察大鼠炎症因子、氧化应激、细胞迁移率、细胞侵袭率、细胞蛋白水平、miR-623、STAT3/NF-κB通路表达量。结果与空白组相比,模型组、低、高剂量组白细胞介素(IL)-1β、C反应蛋白(CRP)、转化生长因子(TGF)-β1、丙二醛、一氧化氮、细胞迁移率、侵袭率、神经型钙黏附素(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、miR-623水平升高,总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、上皮型钙黏附素(E-cadherin)、STAT3、NF-κB降低,具有统计学差异(均P<0.05);与模型组相比,低、高剂量组IL-1β、CRP、TGF-β1、丙二醛、一氧化氮、细胞迁移率、侵袭率、N-cadherin、Vimentin、miR-623水平降低,T-AOC、SOD、E-cadherin、STAT3、NF-κB上升,具有统计学差异(均P<0.05);与低剂量组相比,高剂量组IL-1β、CRP、TGF-β1、丙二醛、一氧化氮、细胞迁移率、侵袭率、N-cadherin、Vimentin、miR-623水平降低,T-AOC、SOD、E-cadherin、STAT3、NF-κB上升,具有统计学差异(均P<0.05)。结论紫草素具有抗炎、抗肿瘤作用,可有效抑制癌细胞上皮间质转化,通过miR-623调控STAT3/NF-κB信号通路抑制细胞蛋白水平,改善免疫功能,减轻氧化应激反应,降低细胞迁移率和侵袭率,起到缓解作用。

miR-147a在宫颈癌Hela细胞中的表达及对Hela 细胞增殖、黏附及迁移的调控作用

目的探讨微小核糖核酸-147a(miR-147a)在宫颈癌Hela细胞中的表达及对宫颈癌Hela细胞增殖、黏附及迁移的调控作用。方法在体外培养人宫颈癌Hela细胞,将对数期生长细胞分为对照组(不进行干预)、mimics NC组(转染mimics NC片段至Hela细胞)、inhibitor NC组(转染inhibitor NC片段至Hela细胞)、miR-147a mimics组(转染miR-147a mimics片段至Hela细胞)及miR-147a inhibitor组(转染miR-147a inhibitor片段至Hela细胞),干预24 h。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测Hela细胞中miR-147a表达水平;采用细胞计数试剂盒-8测定细胞活力;采用5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷测定细胞的增殖率;采用细胞黏附实验测定细胞的黏附能力;采用Transwell小室法测定细胞的迁移能力;采用蛋白免疫印迹法测定细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和核转录因子-κB(NF-κB)通路相关蛋白表达水平。结果miR-147a mimics组miR-147a表达水平明显高于mimics NC组(P<0.05),miR-147a inhibitor组miR-147a表达水平明显低于inhibitor NC组(P<0.05),miR-147a mimics、miR-147a inhibitor转染成功。与mimics NC组相比,miR-147a mimics组细胞活力、增殖率、黏附数、迁移数及cyclin D1、磷酸化(p)-NF-κB蛋白表达水平明显下降(P<0.05);与inhibitor NC组相比,miR-147a inhibitor组细胞活力、增殖率、黏附数、迁移数及cyclin D1、p-NF-κB蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论过表达miR-147a通过调控NF-κB通路抑制宫颈癌细胞的增殖、黏附及迁移能力。

基于NF-κB/miR-494信号调控MUC5AC和CFTR研究小青龙汤与清气化痰丸改善病理性气道黏液的机制

目的观察小青龙汤和清气化痰丸对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的人肺癌细胞H292黏液高分泌模型及核转录因子-κB/微小RNA-494(NF-κB/miR-494)信号通路相关分子的影响,探讨两者改善病理性气道黏液的作用机制。方法采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测不同浓度小青龙汤、清气化痰丸对IL-1β诱导的H292细胞活性的影响并选择合适浓度进行后续实验。将细胞随机分为空白组、模型组(5μg/L IL-1β)、NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC)组(5μg/L IL-1β+100μmol/L PDTC)、小青龙汤组(5μg/L IL-1β+1000 mg/L小青龙汤)和清气化痰丸组(5μg/L IL-1β+1000 mg/L清气化痰丸);采用5μg/L IL-1β诱导H292细胞24 h建立气道上皮黏液高分泌细胞模型。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞分泌黏蛋白5AC(MUC5AC)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-8水平及细胞内MUC5AC和囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)蛋白含量;采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测MUC5AC mRNA、CFTR mRNA和miR-494的表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测NF-κB信号通路关键蛋白p65和NF-κB抑制因子(IκB)的蛋白表达。结果选择浓度为1000 mg/L的小青龙汤和清气化痰丸进行后续实验。与空白组比较,模型组细胞分泌MUC5AC、TNF-α和IL-8水平显著升高,细胞内MUC5AC蛋白含量和mRNA表达也显著升高,细胞内CFTR蛋白含量和mRNA表达均显著降低,且细胞内p65蛋白表达显著上调,IκB蛋白表达显著下调,miR-494表达显著升高。与模型组相比,PDTC组、小青龙汤组和清气化痰丸组细胞分泌MUC5AC、TNF-α、IL-8水平显著降低,细胞内MUC5AC蛋白含量和mRNA表达也显著降低,且细胞内p65蛋白表达均显著下调,IκB蛋白表达均显著上调,miR-494表达均显著降低;PDTC组和清气化痰丸组细胞内CFTR蛋白含量和mRNA表达均显著升高。与PDTC组相比,小青龙汤组细胞分泌TNF-α水平显著升高(ng/L:22.77±3.14比11.09±3.37,P<0.05),细胞内CFTR蛋白含量和mRNA表达、IκB蛋白表达均显著降低〔CFTR蛋白(ng/L):97.38±6.62比227.04±19.48,CFTR mRNA(2^(-ΔΔCt)):0.99±0.08比1.21±0.08,IκB/β-actin:1.69±0.11比2.00±0.18,均P<0.05〕;清气化痰丸组细胞分泌TNF-α水平显著升高(ng/L:19.08±3.71比11.09±3.37,P<0.05)。与小青龙汤组相比,清气化痰丸组细胞内CFTR蛋白含量和mRNA表达、IκB蛋白表达均显著升高〔CFTR蛋白(ng/L):235.01±22.71比97.38±6.62,CFTR mRNA(2^(-ΔΔCt)):1.32±0.15比0.99±0.08,IκB/β-actin:1.94±0.16比1.69±0.11,均P<0.05〕。结论小青龙汤改善气道上皮黏液高分泌炎症的机制可能与抑制NF-κB/miR-494炎症信号介导的MUC5AC高分泌有关,而清气化痰丸则可能与抑制NF-κB/miR-494炎症信号介导的MUC5AC高分泌及CFTR功能障碍有关,因此,二者治疗病理性气道黏液的机制差异主要在对CFTR基因和蛋白的调控上。

MiR-9-5p调控瞬时受体电位M7对心肌缺血/再灌注大鼠的保护作用

目的探讨miR-9-5p调控瞬时受体电位M7(TRPM7)对心肌缺血/再灌注(MIR)大鼠的作用。方法将32只SD大鼠分为假手术组、模型组、miR-9-5p过表达组及空载体对照组,通过左冠状动脉结扎法建立MIR模型,假手术组不结扎,miR-9-5p过表达组和空载体对照组于模型建立前24 h分别尾静脉注入miR-9-5p agomir和agomir NC。通过HE染色观察各组大鼠心肌损伤情况;Real-time PCR检测各组大鼠心肌组织中miR-9-5p表达水平;酶联免疫吸附测定法检测各组大鼠血清中白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1β、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)、乳酸脱氢酶(LDH)水平以及心肌组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量;TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况;双荧光素酶实验验证miR-9-5p与TRPM7的关系;免疫印迹法检测各组大鼠TRPM7、Bcl-2、Bax、磷酸化核因子κB 65(p-NF-κB p65)、toll样受体4(TLR4)蛋白表达。结果MiR-9-5p在大鼠心肌组织中低表达(P<0.05);miR-9-5p过表达能够降低CK-MB、cTnI、LDH表达水平,改善大鼠心肌损伤程度;与模型组相比,miR-9-5p过表达组心肌细胞凋亡率、Bax蛋白表达及MDA、IL-6、TNF-α及IL-1β含量均下降,而Bcl-2蛋白表达和SOD含量上升(P<0.05);双荧光素酶实验结果显示,TRPM7为miR-9-5p的靶基因,且miR-9-5p过表达组TRPM7、p-NF-κB p65、TLR4蛋白表达均较模型组降低(P<0.05)。结论MiR-9-5p通过调控TRPM7抑制心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡、氧化应激及炎症反应,并抑制TLR4/NF-κB通路。

黄芪多糖通过miR-146a介导STAT3/ReIA通路改善溃疡性结肠炎的研究

目的探讨黄芪多糖抑制溃疡性结肠炎(UC)的细胞凋亡和活性氧(ROS)产生的具体机制。方法用脂多糖体外构建UC损伤细胞模型。将细胞分为对照组(NCM460细胞不做任何处理),模型组(UC损伤细胞模型),空白组和低、中、高剂量组(构建UC损伤细胞模型分别用0、50、100、200μg·mL^(-1)黄芪多糖处理),联合组[高剂量组的基础上转染微小RNA-146a模拟物(miR-146a mimic)]。用实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞中miR-146a相对表达水平,用试剂盒检测细胞上清液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针法检测细胞内ROS产生水平,用原位末端转移酶标记技术检测细胞凋亡率,用蛋白质印迹法检测细胞中信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)/核因子κB p65亚基(ReIA)信号通路相关蛋白相对表达水平。结果对照组、模型组和高剂量组miR-146a相对表达水平分别为1.00±0.18、3.12±0.42和2.02±0.31;对照组、模型组、高剂量组和联合组MDA水平分别为(10.11±0.19)、(41.21±5.85)、(27.58±3.33)和(38.85±4.25)μmol·g^(-1),SOD水平分别为(132.22±15.24)、(60.52±6.86)、(112.10±12.56)和(91.22±10.52)U·mg^(-1),ROS相对荧光强度分别为1.00±0.25、2.85±0.32、1.54±0.19和2.77±0.30,细胞凋亡率分别为(8.62±1.02)%、(45.62±6.11)%、(27.32±3.52)%和(40.62±5.62)%,STAT3蛋白相对表达水平分别为1.00±0.18、1.96±0.22、1.30±0.19和1.78±0.20,ReIA蛋白相对表达水平分别为1.00±0.15、2.32±0.39、1.50±0.25和2.22±0.33,对照组、高剂量组的上述指标与模型组比较,联合组和高剂量组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.001)。结论黄芪多糖可能通过下调miR-146a表达来抑制STAT3/ReIA信号通路的激活,从而发挥抑制UC细胞凋亡以及ROS产生的作用。