核转录因子NFAT5对LPS致伤小鼠肾集合管细胞iMCD3的影响

目的研究核转录因子激活T细胞核因子(NFAT5)在脓毒症并发急性肾损害调节炎症瀑布效应的作用。方法体外培养小鼠肾集合管细胞iMCD3,用LPS(10 ng/ml)刺激细胞,同时加入NFAT5 siRNA,12 h后,qRT-PCR和ELISA检测炎症因子TNFα和MCP-1的基因水平和蛋白水平,Western blot检测细胞核内NFAT5蛋白表达水平,并用染色质免疫共沉淀(ChIP)分别检测NFAT5和TNFα及MCP-1启动子片段结合的富集倍数。结果LPS(10 ng/ml)刺激肾集合管细胞导致炎症因子TNFɑ和MCP-1的转录合成显著升高(P<0.05),利用siRNA沉默NFAT5后,TNFα和MCP-1的转录及合成均下降。虽然使用Western blot未能检测到LPS刺激iMCD3其核内NFAT5蛋白表达水平增加,但是使用ChIP探测到NFAT5可以分别与TNFɑ和MCP-1启动子片段结合,开启炎症因子转录及蛋白合成。结论核转录因子NFAT5参与调节脓毒症并发肾损害的炎症瀑布效应,通过直接结合肾小管细胞中炎症因子TNFα和MCP-1的启动子发挥独特作用。

2型糖尿病合并骨质疏松患者血清miR-9-5p和NFAT5的表达及其与骨折的关系

目的:2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种多病因代谢性疾病,骨质疏松(osteoporosis,OP)和骨折是其常见并发症。本研究旨在探讨T2DM合并OP患者血清中微RNA(microRNA,miR)-9-5p和核转录因子5(nuclear factor of activated T-cells 5,NFAT5)的表达水平,以及其与骨折的关系。方法:收集郑州市第七人民医院就诊的T2DM合并OP患者184例(OP组),另纳入同时间段单纯T2DM患者184例(T2DM组)。实时聚合酶链反应检测血清miR-9-5p、NFAT5表达水平。随访2年,根据新发骨折情况,将T2DM合并OP患者分为骨折组(43例)与无骨折组(141例)。Pearson法分析血清miR-9-5p、NFAT5分别与空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、I型前胶原N末端前肽(procollagen I N-terminal propeptide,PINP)、空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)、胰岛素抵抗指数(insulin resistance index,HOMA-IR)、骨密度T值、I型胶原羧基端β降解产物(type I collagen hydroxy terminal peptideβdegradation products,β-CTX)相关性,以及miR-9-5p与NFAT5的相关性;采用受试者操作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲线评估血清miR-9-5p、NFAT5对T2DM合并OP患者骨折的预测价值,多因素logistic回归分析T2DM合并OP患者骨折的影响因素。结果:OP组血清miR-9-5p水平高于T2DM组,NFAT5水平低于T2DM组(均P<0.05)。与无骨折组相比,骨折组患者糖尿病病程、FPG、HOMA-IR、β-CTX、miR-9-5p水平均升高,而PINP、NFAT5水平均降低(均P<0.05)。骨折患者血清miR-9-5p与NFAT5水平呈负相关(r=−0.716,P<0.05);miR-9-5p水平与FPG、HOMA-IR、β-CTX均呈正相关,与PINP呈负相关(均P<0.05),而血清NFAT5水平与FPG、HOMA-IR、β-CTX均呈负相关,与PINP呈正相关(均P<0.05)。血清miR-9-5p、NFAT5单一预测T2DM合并OP患者骨折风险的曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.878和0.868,联合预测的AUC为0.933。β-CTX、miR-9-5p为T2DM合并OP患者骨折的危险因素,PINP、NFAT5为T2DM合并OP患者骨折的保护因素(均P<0.05)。结论:T2DM合并OP患者血清miR-9-5p表达水平升高,NFAT5表达水平降低,两者与骨折发生均有一定关系,miR-9-5p联合NFAT5对骨折预测价值更高。

基于核转录因子-κB信号通路研究小青龙汤对肺癌H292细胞分泌黏蛋白5AC的调控机制

目的探讨小青龙汤对人肺癌H292细胞活性及分泌黏蛋白5AC(MUC5AC)的影响,研究小青龙汤治疗肺癌的分子机制.方法选用对数分裂期的H292细胞,实验分为空白对照组、炎症模型组、核转录因子-κB(NF-κB)通路抑制剂组〔吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)100μmol/L〕、小青龙汤高、中、低剂量组(1000、500、250 mg/L).采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各剂量组小青龙汤对H292细胞活性的影响;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的H292细胞分泌MUC5AC的量以及高、中剂量小青龙汤对炎症模型细胞分泌MUC5AC、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测小青龙汤对炎症模型细胞NF-κB信号通路及其抑制蛋白(IκB)和P65蛋白表达的影响.结果与空白对照组比较,小青龙汤作用于细胞24 h和48 h后其吸光度值(A值)均明显降低,并呈现剂量依赖性,其中小青龙汤1000 mg/L和500 mg/L 2个浓度对细胞的抑制率比较适合后续实验.与炎症模型组比较,PDTC组、小青龙汤高、中剂量组MUC5AC、IL-8、TNF-α的分泌均明显降低,其中以小青龙汤高剂量组降低最为明显〔MUC5AC(ng/L):胞外含量为1318.63±126.86比2531.94±87.77,胞内含量为1048.96±54.33比1217.57±80.77,IL-8(ng/L):583.94±28.04比832.01±73.48,TNF-α(ng/L):104.99±6.79比151.95±8.21,均P<0.05〕.Western Blot结果显示:与空白对照组比较,炎症模型组中IκB的表达明显降低(IκB/β-actin:0.5246±0.0641比0.9182±0.1172,P<0.05),P65表达明显升高(P65/β-actin:1.2031±0.0379比0.9787±0.1605,P<0.05);与炎症模型组比较,PDTC组、小青龙汤高剂量组IκB表达均明显升高(IκB/β-actin:0.9352±0.0833、0.8178±0.0578比0.5246±0.0641,均P<0.05),而P65的表达均明显降低(P65/β-actin:0.8636±0.0592、0.9313±0.1133比1.2031±0.0379,均P<0.05).结论中、高剂量小青龙汤效果最佳,可抑制肺癌H292细胞活性,降低细胞MUC5AC分泌,减少IL-8、TNF-α释放,这可能与调控NF-κB信号通路有关.

创伤后IL-2表达受抑与核转录因子NFAT变化的关系

为探讨创伤后脾细胞核转录因子 (nuclearfactorofactivatedT cells,NFAT)的DNA结合活性变化和IL 2表达受抑间的关系 ,采用小鼠双后肢闭合性砸伤 +骨折模型 ,于创伤后 12h及 1、4、7、10、14天处死动物 ,分离脾细胞 ,经ConA刺激细胞后收集培养上清以测定IL 2活性 ;提取脾细胞RNA以测定IL 2mRNA ;提取脾细胞核蛋白 ,用电泳迁移率改变试验 (electrophoreticmobilityshiftassay ,EMSA)检测NFAT的DNA结合活性。结果显示 ,创伤后脾细胞NFAT的DNA结合活性逐渐下降 ,至伤后 4天时下降最明显 ,仅为正常对照组的 41%。这与创伤后IL 2活性和IL 2mRNA的降低相一致。结果表明 ,创伤后IL 2表达受抑至少部分是由于NFAT的DNA结合活性降低所致。这对于阐明创伤后IL 2受抑的机制具有重要意义。

核转录因子κB在5/6肾切除大鼠肾组织中的表达规律

目的 探讨5/6肾切除大鼠模型肾组织中核转录因子κB（NF-κB）的表达规律.方法 将48只雄性SD大鼠随机分为5/6肾切除模型组（24只）和假手术组（24只）,两组分别于术后第2周、第6周、第12周和第16周时测定血肌酐（Scr）,采用凝胶电泳迁移率实验检测肾组织NF-κB活性的表达情况,同时于光镜下观察肾脏组织形态学改变,并计算肾小球硬化指数（GSI）.结果 模型组各时点的Scr水平均较相同时点的假手术组显著增高（均P〈0.01）;模型组大鼠随着时间点延长Scr水平逐渐升高,以术后第16周时最高（均P〈0.05）.模型组术后第12周时可见肾小球体积增大、中重度系膜增生、部分毛细血管腔狭窄,偶见肾小球节段硬化;术后第16周时可见多数肾小球节段硬化,少数肾小球球性硬化;模型组术后第16周时的GSI较第12周时增高（P〈0.05）.模型组各时点的NF-κB水平均较相同时点的假手术组显著增高（均P〈0.01）;模型组的NF-κB水平在术后第2周、第6周、第12周、第16周时的信号呈递增趋势,以术后第16周时表达水平最高（均P〈0.05）.残肾组织NF-κB的活性表达与Scr和GSI呈正相关.结论 在5/6肾切除大鼠模型术后第2周至第16周中,肾组织NF-κB的活性随着肾功能减退而逐渐增强.

辛芷鼻敏胶囊对大鼠变应性鼻炎脾脏组织核转录因子-κB和白介素-5表达的影响及相关性

目的探讨辛芷鼻敏胶囊对实验性大鼠变应性鼻炎(A llergic rh in itis,AR)脾脏组织核转录因子-κB(Nuc lear factorkappa B,NFκ-B)和白介素-5(Interleuk in-5,IL-5)表达及相互关系的作用,明确药效机理。方法通过造模的大鼠灌服辛芷鼻敏胶囊及与同类药物对照,用免疫组化Evision方法半定量检测脾脏组织NFκ-B(亚单位P65)的活性细胞表达及双抗体夹心酶联免疫吸附技术(Enzym e labeled immunosorbent assay,ELISA)定量测定IL-5的表达。结果实验药物组的NF-κBP65的阳性细胞比例和IL-5含量明显低于模型组及阳性对照组(P<0.05);且NFκ-BP65的活性细胞比例与IL-5的表达呈正相关(r=0.935 5、P<0.05)。结论辛芷鼻敏胶囊可能通过降低核转录因子-κB活性,抑制大鼠AR发病过程中IL-5的表达,进而减少嗜酸粒细胞(Eosinoph il,EOS)的浸润而控制症状。

微小RNA-7-5p靶向调节锌指蛋白核转录因子4基因抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖和诱导凋亡的体外研究

目的探讨微小RNA(miR)-7-5p对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡及锌指蛋白核转录因子4(KLF4)基因表达调控的影响。方法研究起止时间为2018年3-10月。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-7-5p在人正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF及口腔鳞状细胞癌细胞SCC25、Cal127和Tca8113中的表达量。将miR-7-5p模拟物(miR-7-5p mimics)及阴性对照序列(mimics Control)分别转染至SCC25细胞,分为三组:Control组(未转染的SCC25细胞)、NC组(转染mimics Con-trol的SCC25细胞)、miR-7-5p组(转染miR-7-5p mimics的SCC25细胞)。以qRT-PCR检测miR-7-5p在SCC25细胞中的转染效果;MTT法检测miR-7-5p对SCC25细胞增殖的影响;流式细胞术检测miR-7-5p对SCC25细胞凋亡的影响;通过双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和蛋白质印迹法(Western blotting)检测miR-7-5p对KLF4的靶向关系。结果miR-7-5p在3种口腔鳞状细胞癌细胞SCC25、Cal127和Tca8113中的表达量[(0.21±0.02)、(0.43±0.04)、(0.48±0.05)]明显低于人正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF(1.00±0.09)(P<0.05);转染miR-7-5p mimics能够上调SCC25细胞中miR-7-5p的表达(P<0.05);miR-7-5p过表达能够明显抑制SCC25细胞增殖能力[Control组、NC组72 h吸光度(1.43±0.13)、(1.46±0.15)比miR-7-5p组(0.81±0.09)](P<0.05),并诱导细胞凋亡[Control组、NC组凋亡率(9.48±2.65)%、(10.21±3.02)%比miR-7-5p组(24.41±8.15)%](P<0.05);双荧光素酶报告基因实验结果表明miR-7-5p过表达可抑制KLF4-Wt报告基因载体细胞相对荧光活性;qRT-PCR和Western blotting进一步证实了miR-7-5p能够靶向调节KLF4 mRNA和蛋白表达。结论miR-7-5p直接靶向调控KLF4基因的表达来抑制口腔鳞状细胞癌SCC25细胞增殖,诱导细胞凋亡。

NOD样受体C5对肝癌细胞SMMC-7721凋亡及核转录因子-κB表达的影响

目的:研究NOD样受体C5(NLRC5)对肝癌细胞SMMC-7721凋亡及核转录因子-κB(NF-κB)表达水平的影响。方法:将NLRC5 miRNA转染至SMMC-7721细胞中使NLRC5低表达,并将SMMC-7721细胞分为对照组、Vector组和NLRC5组。比较3组细胞中NLRC5 mRNA的表达、凋亡率、增殖能力和NF-κB蛋白和相对表达量。结果:正常肝细胞中NLRC5 mRNA表达显著低于肝癌细胞。对照组和Vector组细胞中NLRC5 mRNA相比较无差异;与对照组相比较,NLRC5组细胞中NLRC5 mRNA的表达显著降低。与对照组比较,Vector组凋亡的肝癌细胞数量无差异;与对照组、Vector组相比,NLRC5组肝癌细胞的凋亡率显著增加。与对照组相比,Vector组细胞的增殖能力无变化;而NLRC5组细胞的增殖能力显著低于对照组和Vector组。与对照组和Vector组相比较,NLRC5组细胞中的NF-κB蛋白和NF-κB mRNA表达显著升高。结论:低表达NLRC5可促进肝癌细胞凋亡,其机制可能与负调控NF-κB有关,进而对肝癌的发生发展起到抑制作用。

桥本甲状腺炎患者外周血单个核细胞程序性死亡因子5的表达及其意义

目的探讨程序性死亡因子5(PDCD5)在桥本甲状腺炎(HT)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其与HT发生发展之间的关系。方法选取华北煤炭医学院附属医院2006年3—8月内分泌门诊或住院HT患者60例(HT组)及同期体检健康者40例(对照组)。并根据HT患者血清抗甲状腺微粒体抗体(TMAb)水平,将HT组患者分为HT1组(TMAb≤45%)36例和HT2组(TMAb>45%)24例。采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定HT组和对照组受检者PBMC PDCD5 mRNA的表达水平,然后比较HT1组和HT2组患者甲状腺功能、血清甲状腺球蛋白抗体(TGAb)水平及PBMC PDCD5 mRNA表达水平。结果 (1)HT组患者PBMC PDCD5mRNA表达阳性率及相对表达水平均高于对照组〔86.7%(52/60)与60.0%(24/40),(0.87±0.19)与(0.38±0.08)〕,差异有统计学意义(χ2=9.355,t=4.870,P均<0.01)。(2)HT2组患者血清TGAb水平及PBMC PDCD5mRNA表达水平均高于HT1组〔(75.1±18.9)%与(50.4±10.7)%,(1.02±0.08)与(0.60±0.12)〕,差异有统计学意义(t值分别为6.400和15.041,P均<0.01)。结论 HT患者PBMC PDCD5 mRNA的表达上调,且随病情加重PDCD5表达增加,提示PDCD5可能通过增加其表达量而导致异常的淋巴细胞凋亡,从而参与HT的发生和发展。

哌拉西林通过调控miR-127-5p影响重症肺炎大鼠炎症因子的分子机制

目的探讨哌拉西林对重症肺炎大鼠炎症因子的影响及分子机制。方法用肺炎克雷伯菌构建重症肺炎大鼠模型,将大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组(50 mg/kg哌拉西林)、中剂量组(100 mg/kg哌拉西林)、高剂量组(200 mg/kg哌拉西林)、anti-miR-con+模型组、anti-miR-127-5p+模型组、anti-miR-con+高剂量组、anti-miR-127-5p+高剂量组。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测炎症因子白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β水平;髓过氧化物酶(MPO)活性测定试剂盒检测MPO活性;Western印迹法检测基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、p-p65蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-127-5p表达水平。结果重症肺炎大鼠模型中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高,MPO活性升高,MMP2、MMP9、p-p65蛋白的相对表达水平升高,miR-127-5p相对表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同剂量哌拉西林处理后,重症肺炎大鼠中IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低,MPO活性降低,MMP2、MMP9、p-p65蛋白的相对表达水平降低,miR-127-5p相对表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。转染miR-127-5p抑制载体质粒后,重症肺炎大鼠中IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高,MPO活性升高,MMP2、MMP9、p-p65蛋白的相对表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。抑制miR-127-5p表达逆转了哌拉西林对重症肺炎大鼠模型组炎症因子和MMP2、MMP9、p-p65的蛋白表达的影响。结论哌拉西林可降低重症肺炎大鼠炎症因子水平,其可能与上调miR-127-5p表达及抑制NF-κB信号通路有关。

基于核转录因子-κB信号通路探讨针灸四关穴治疗偏头痛的机制

目的:基于核转录因子-κB信号通路(NF-κB)探讨针灸四关穴治疗偏头痛疗效。方法:选取2018年2月至2019年2月广州中医药大学祈福医院收治的偏头痛患者114例作为研究对象,按照随机数字表法随机分为对照组和观察组,每组57例。对照组采用常规西药治疗,观察组在常规西药治疗的基础上加用针灸四关穴治疗,均治疗4周。比较2组症状积分、临床疗效、NF-κB信号通路及其相关指标变化。结果:治疗后2组降钙素原基因相关肽(CGRP)、VAS评分、症状持续时间、发作频率、NF-κB、环氧合酶抑制剂(COX-2)、白细胞介素-1β(IL-1β)、一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、大脑前动脉(ACA)、大脑中动脉(MCA)、大脑后动脉(PCA)、椎动脉(VA)、基底动脉(BA)平均血流速度均较治疗前下降,差异均有统计学意义(P<0.05),而β-内啡肽(β-EP)和5-羟色胺(5-HT)均较治疗前升高,差异均有统计学意义(P<0.05),且观察组优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组总有效率为87.72%,高于对照组的71.93%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:四关穴能改善NF-κB信号通路,改善大脑动脉血流速度,从而改善偏头痛症状。

干扰miR-483-5p对骨关节炎软骨细胞增殖及炎症因子的影响

目的探讨miR-483-5p对骨关节炎软骨细胞增殖及炎症因子的影响及机制。方法分离培养骨关节炎软骨细胞,将其分为Con组、miR-483-5p inhibitor组、miR-483-5p inhibitor+LPS组;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞周期;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6水平;Western印迹检测蛋白表达。结果与Con组相比,miR-483-5p inhibitor组软骨细胞存活率明显升高,G0-G1期细胞所占比例明显降低,S期细胞所占比例明显升高,TNF-α、IL-6水平明显降低,TLR4、NF-κB p65蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与miR-483-5p inhibitor组相比,miR-483-5p inhibitor+LPS组软骨细胞存活率明显降低,G0-G1期细胞所占比例明显升高,S期细胞所占比例明显降低,TNF-α、IL-6水平明显升高(P<0.05)。结论干扰miR-483-5p可抑制骨关节炎软骨细胞的增殖及炎症因子的释放,其机制可能与Toll样受体(TLR)4/核转录因子(NF)-κB信号通路有关。

祛风通络方对5/6肾切除大鼠肾间质纤维化相关因子NF-κB及E-cad表达的影响

目的观察祛风通络方对5/6肾切除大鼠肾间质纤维化相关核转录因子κB(Nuclear factorκB,NF-κB)、E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)的影响。方法54只雄性SD大鼠随机分为假手术组(A组)9只、5/6肾切除造模大鼠45只。其中5/6肾切除大鼠按照其干预方式又分为模型组(B组)、洛丁新组(C组)、祛风通络方高剂量组(D组)、祛风通络方中剂量组(E组)、祛风通络方低剂量组(F组)。4周干预后检测各组大鼠24 h尿蛋白定量、血清肌酐及尿素氮;通过RT-PCR及免疫组化法检测肾脏组织中NF-κB及E-cad的表达,Masson染色观察肾组织病理形态。结果干预结束后,与模型组比较,干预各组肾功能均有改善,尿蛋白、血清肌酐及尿素氮下降(P<0.01),干预各组肾组织NF-κB表达下降(P<0.05),而E-cad表达上调(P<0.05),组间比较,祛风通络方高剂量组与洛丁新组效果明显。结论祛风通络方对肾小管间质纤维化有改善作用,其机制主要是通过下调肾组织NF-κB及上调E-cad等相关因子的表达。

TRAF5通过调控IL-17A/NF-κB信号通路减轻氧-糖剥夺/再灌注引起的心肌细胞炎症和细胞凋亡

目的 探讨肿瘤坏死因子受体相关因子5(tumor necrosis factor receptor-associated factor 5,TRAF5)对氧-葡萄糖剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)引起的心肌细胞炎症和细胞凋亡的影响及相关分子机制。方法 体外培养大鼠心肌细胞系H9c2细胞,构建OGD/R诱导的H9c2细胞模型,以脂质体转染法将TRAF5过表达质粒(pcDNA-TRAF5)和空载质粒(pcDNA-NC)转染至OGD/R诱导的H9c2细胞。采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测细胞中TRAF5基因表达,CCK-8法测定细胞活力,试剂盒法检测细胞中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)和炎性因子水平,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中相关蛋白表达。结果 与对照组比较,OGD/R组H9c2细胞中TRAF5 mRNA和蛋白表达量降低,细胞活力降低,细胞中LDH、cTnT、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)浓度升高,细胞凋亡率升高,细胞中B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达量降低,Bcl-2相关蛋白(B-cell-lymphoma-2 related protein,Bax)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteine aspartate proteolytic enzyme-3,cleaved caspase-3)、白细胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)蛋白表达量及磷酸化核转录因子-κB(phosphorylated nuclear factor-κB,p-NF-κB)/NF-κB比值升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与OGD/R组比较,OGD/R+pcDNA-TRAF5组H9c2细胞中TRAF5 mRNA和蛋白表达量升高,细胞活力升高,细胞中LDH、c TnT、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1浓度降低,细胞凋亡率降低,细胞中Bcl-2蛋白表达量升高,Bax、cleaved caspase-3、IL-17A蛋白表达量及p-NF-κB/NF-κB比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TRAF5可减轻OGD/R引起的心肌细胞炎症和细胞凋亡,其作用机制可能与调控IL-17A/NF-κB信号通路有关。

丙型肝炎病毒核心蛋白对胆管癌细胞NFAT1基因表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV C)是否通过调控转录因子NFAT1的表达参与肝内胆管癌的发展及恶性生物学行为。方法构建表达HCV C核心蛋白的真核表达质粒pEGFP-N3-HCV C,通过瞬时转染pEGFP-N3-HCV C质粒,RT-PCR检测肝内胆管癌RBE细胞中NFAT1 mRNA的表达情况,Western blot检测NFAT1蛋白的表达情况,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期变化情况。结果转染HCV C后胆管癌细胞NFAT1基因的mRNA及蛋白表达明显上升,差异具有显著性(P<0.05);HCV C能够促进细胞向G2/M期进展及使细胞增殖能力增加。结论 HCV C可上调胆管癌细胞中NFAT1基因的表达,促进细胞周期进展及胆管癌细胞增殖,可能与肝内胆管癌的发展有关。

SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的分化

背景:移植间充质干细胞预防和治疗椎间盘退变是一种可行的方法,将SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞,使其向髓核细胞转化,以期获得更大的髓核诱导和促增殖效应。目的:探讨SOX-9和GDF-5基因共同诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的效果。方法:提取、分离、纯化4周龄新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞分为5组体外诱导其向类髓核细胞分化,分别为未转染组、空载体转染组、SOX-9转染组、GDF-5转染组、共转染组。转染后第14天采用RT-PCR检测SOX-9,GDF-5和Ⅱ型胶原的m RNA表达,免疫组化染色法检测髓核细胞标记物KRT19表达。结果与结论:共转染组SOX-9 m RNA表达高于转染SOX-9组,差异有显著性意义(P<0.05);共转染组GDF-5m RNA表达高于转染GDF-5组,差异有显著性意义(P<0.05)。共转染组Ⅱ型胶原表达高于转染SOX-9组、转染GDF-5组,差异有显著性意义(P<0.05)。SOX-9转染组及GDF-5转染组KRT19呈阳性表达,共转染组呈强阳性表达,可见被转染的骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化,且双基因转染诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的能力和分泌细胞外基质的能力明显高于单基因转染。

人重组C5a对微血管内皮细胞表达组织因子的影响

目的研究人重组C5a（human—recombinant C5a，rh—C5a）对人肺微血管内皮细胞（human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMECs）表达组织因子（tissue factor，TF）的影响。方法用不同浓度（100、200、300μg／L）的rh—C5a刺激HPMECs 8h和同一浓度（200μg／L）的rh—C5a刺激HPMECs 4、8、12h。采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测TF基因和蛋白表达情况。选取刺激浓度为200μg／L，作用时间为8h组进行C5a反义肽R4干预，相同的方法检测TF基因和蛋白表达并用免疫组织化学方法定性检测NF—κB p65变化。结果正常的HPMECs基本不表达TF，rh—C5a刺激后，TF mRNA和蛋白开始表达，刺激的12h内呈现出时效和量效关系（P〈0．05）。用C5a反义肽R4干预后，TF mRNA水平降至未干预组的68％（P〈0．05），蛋白表达也有下降。免疫组织化学示p65在胞浆内明显增加并有部分人核。结论在刺激的12h内，C5a对HPMECs表达TF存在时间-浓度的依赖关系，机制可能是C5a与其受体结合后，通过细胞信号转导途径活化NF—κB，从而调节基因和蛋白的表达。

同型半胱氨酸对核因子-κB活性及白三烯E_4和前列腺素E_2合成水平的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人结肠腺癌(Caco-2)细胞中白三烯E_4(LTE_4)、前列素E_2(PGE_2)合成水平和核转录因子-κB(NF-κB)活性的影响。方法在Caco-2细胞中加入不同浓度(0、10、20、50μmol/L)Hcy作用不同时间(1、3、6 h),采用MTT法和检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,观察Hcy对Caco-2细胞生长活性的影响;通过检测Caco-2细胞跨膜电阻(TEER)和样品中荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)浓度,观察Hcy对Caco-2细胞通透性的影响;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定Caco-2细胞上清液中LTE_4和PGE_2合成水平;采用凝胶迁移实验(EMSA)测定Caco-2细胞中NF-κB活性变化。结果随Hcy作用时间延长及作用浓度增加,Caco-2细胞活性明显受到抑制;随Hcy作用浓度增加,Caco-2细胞TEER明显降低,FITC跨膜转运量明显增加,细胞上清液中LTE_4和PGE_2水平明显升高(P<0.05);Hcy(50μmol/L)处理组细胞中NF-κB活性增强,且呈时间依赖性(1、3、6 h)。结论 Hcy通过激活NF-κB信号通路,促进Caco-2细胞肠黏膜LTE_4和PGE_2合成,引起肠黏膜炎症损伤。

Downregulation of NFAT5 by RNA interference reduces monoclonal antibody productivity of hybridoma cells

Hybridoma 房间在抗体生产率追随者暴露显示增加到张力亢进的条件。然而，内在的机制很好没被理解。在现在的学习，我们假设激活的 T 房间的原子因素 5 (NFAT5 )/tonicityenhancer 绑定蛋白质(TonEBP ) 工作增加 hybridomacells 的抗体生产率。NFAT5 是 osmosensitive 哺乳动物的抄写因素。然而，它在没在张力亢进的周围被洗的各种各样的器官的无所不在的表示建议 NFAT5 可以也在等渗的条件下面调整细胞生长和功能。在这研究，我们由西方的污点分析在 hybridoma 房间检验了表示 ofNFAT5，并且发现它在张力亢进的媒介显著地增加了。为了推进，在 hybridoma 房间定义 NFAT5 的功能， RNA 干扰技术习惯于 down 在 SGB-8 房间(一根 hybridoma 房间线) 调整 NFAT5 的表示。在等渗的媒介， hybridoma 房间的抗体生产率被 NFAT5while 的 down 规定减少细胞增殖没被影响。这里介绍的结果表明那 NFAT5 不仅在 hybridoma 房间在渗透的压力反应小径起一个重要作用而且为最佳的抗体生产率是必要的。

α2B-肾上腺素能受体与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2共表达稳转细胞株的构建

目的建立能够稳定表达α2B-肾上腺素能受体(α2B-AR)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的活化T细胞核因子2(NFAT2)(EGFP-NFAT2)的稳转细胞株。方法构建具有潮霉素(Hydro)抗性的pcDNA3.1α2B-AR重组质粒(pcDNA3.1-Hygro-α2B-AR),转染至表达EGFP-NFAT2的U2OS细胞(U2OS-EGFP-NFAT2细胞),使用Hygro 200 mg·L-1压力筛选10 d后,进行NFAT2核转位实验筛选细胞株并用Z’因子法评价细胞模型的可靠性,采用实时定量PCR和Western蛋白印迹法,检测α2B-AR的mRNA和蛋白表达水平,选择α2-AR的激动剂盐酸右美托咪啶(DMED)和拮抗剂盐酸阿替美唑(ATI)通过NFAT2核转位实验评价α2B-AR的功能活性。结果成功构建重组质粒pc DNA3.1-Hygro-α2B-AR后,稳定转染至U2OS-EGFP-NFAT2细胞,采用NFAT2核转位实验筛选发现,编号12的细胞株相对核转位指数为0.445,活性最高;3次独立实验中,Z’因子分别为0.664,0.533和0.634。实时定量PCR结果显示,编号12的细胞株α2B-AR mRNA表达水平是U2OS-EGFP-NFAT2细胞株的140倍,表达显著增加(P<0.01),且在20代次内表达稳定。Western蛋白印迹结果显示,编号12的细胞株出现明显的α2B-AR蛋白条带,而U2OS-EGFP-NFAT2细胞中未检测到α2B-AR蛋白表达。DMED可以浓度依赖性地提高该细胞株的核转位水平[EC50=(2.616±0.121)nmol·L-1],ATI可以浓度依赖性地对抗DMED的作用[IC50=(89.05±0.22)nmol·L-1]。结论成功构建了共表达α2B-AR与EGFP-NFAT2的稳转细胞株,可用于靶向α2B-AR化合物的筛选和受体分子机制的研究。