抗原特异TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCRV β13-pIRES2-EGFP真核表达载体的构建及共转染研究

目的构建携带弥漫大B型非霍奇金淋巴瘤(DLBL)相关抗原特异性的TCR Vα和TCR Vβ基因片段的真核表达载体TCR Vα-pIRES2-EGFP和TCR Vβ-pIRES2-EGFP,将其共同转染Raji和Jurkat细胞。方法前期研究从1例DLBL患者外周血T细胞中发现克隆性增殖T细胞受体(TCR)Vα6和Vβ13亚家族T细胞,在此基础上利用RT-PCR扩增TCR Vα6和TCR Vβ13基因全长序列后,分别将其定向克隆入带有绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pIRES2-EGFP,酶切和核酸序列测定分析方法鉴定重组质粒TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP的正确性;利用核转染技术(nucleofector)将其分别或共同转染Raji细胞和Jurkat细胞,24 h后利用激光共聚焦显微镜观察EGFP的瞬时表达情况,48 h后利用实时定量PCR检测TCR Vα6和TCR Vβ13基因的表达情况,Western blot检测EGFP蛋白的表达情况。结果获得来自DLBL患者的TCR Vα6和TCR Vβ13基因全长序列,酶切分析和核酸序列测定证实TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP重组质粒构建正确;转染24 h后,激光共聚焦显微镜下可观察到EGFP的表达,40%以上细胞发出绿色荧光,单独转染和共转染组荧光产生情况相似;实时定量PCR在单独转染和共转染组均可检测到TCR Vα6和TCR Vβ13基因的表达,共转染组2基因的表达水平稍低于单独转染组;Western blot检测在单独转染和共转染组均显示EGFP蛋白的表达,2组的蛋白杂交带强度相似。结论成功构建了DLBL特异性的TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP真核表达质粒,两者可同时转染到细胞中,并实现了体外共表达。

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肝癌细胞转染

目的构建正义和反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肝癌细胞株MHCC97-L及高转移细胞株MHCC97-H和HCCLM6。方法采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认。用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肝癌细胞株MHCC97-L,反义真核表达载体转入人高转移肝癌细胞株MHCC97-H和HCCLM6,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果。结果经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3 kb和1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5 kb和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;测序结果进一步确认了方向的正确性。转染成功的肝癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光。结论成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肝癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肝癌细胞的转移能力的影响奠定了基础。

裸鼠模型的人钠/碘转运体基因转染人大细胞肺癌介导放射性核素显像

目的在动物体内实验观察人钠/碘转运体(hNIS)基因转染人大细胞肺癌介导放射性核素显像是否可行。方法①利用重组质粒以脂质体转染法将hNIS基因转染入人大细胞肺癌H460细胞系中,获得稳定表达hNIS的细胞株(hNIS-H460)。②用hNIS-H460细胞株建立大细胞肺癌荷瘤裸鼠模型,进行放射性核素99mTcO4-显像和131I显像。结果①体外实验表明hNIS-H460细胞株可以摄取碘。②裸鼠大细胞肺癌(hNIS-H460)移植瘤的99mTcO4-和131I显像结果较清晰。结论转染后的hNIS-H460细胞具有一定的摄碘能力。裸鼠大细胞肺癌(hNIS-H460)移植瘤可以进行99mTcO4-和131I显像;99mTcO4-显像的质量优于131I显像。

A20基因转染对大鼠颈动脉再狭窄和核因子κB表达的影响

目的观察局部转染锌指蛋白A20基因对大鼠颈动脉再狭窄模型球囊损伤后内膜增生和血管平滑肌细胞增殖的影响并探讨其可能的机制。方法建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型。104只健康雄性SD大鼠随机分为4组(n=26):假手术组、模型组、对照组和治疗组。假手术组只进行颈动脉结扎,不进行球囊损伤术;模型组只进行球囊损伤术,不进行局部转染治疗;对照组球囊损伤术后局部灌注Lipofectamine 2000 Reagent+TE buffer;治疗组球囊损伤术后局部灌注Lipofectamine 2000 Reagent+pCAGGS-GFP/A20重组质粒。荧光显微镜观察A20在损伤动脉壁的转染效率;病理组织学观察内膜增生情况;溴脱氧尿嘧啶核苷标记技术评估血管平滑肌细胞的增殖指数;分别用免疫组织化学染色、Western-blotting方法检测核因子κB p65在各组大鼠颈总动脉中的表达情况。结果大鼠颈总动脉球囊损伤术后14 d模型组和对照组血管内膜显著增生。A20基因转染可抑制新内膜面积的增加(减少47.8%,P<0.05)和内/中膜比值的增加(减少42.9%,P<0.05)。术后10 d治疗组血管平滑肌细胞体内增殖指数(9.6%±2.3%)显著少于对照组(26.7%±5.1%,P<0.05)。术后10 d治疗组血管壁细胞核因子κB p65阳性细胞率显著低于对照组(P<0.05)。术后7 d、14 d和28 d治疗组血管组织核因子κB p65的蛋白表达量显著低于对照组(P<0.05)。结论局部转染A20基因可抑制损伤血管内膜增生及平滑肌细胞的增殖,其分子机制可能通过其负反馈抑制了核因子κB介导的胞内信号转导途径。

腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔椎间盘对髓核细胞I型、II型胶原的影响

目的:观察腺病毒载体介导外源性人转化生长因子(Ad/CMV-hTGF-β1)对兔椎间盘髓核细胞Ⅰ型、Ⅱ型胶原的影响。方法:纯种成年新西兰大白兔20只,随机分为实验组和对照组,每组10只。于实验组兔腰3、4椎间盘髓核内注射Ad/CMV-hTGF-β1(6×106pfu),注射量为20μl,对照组则注射20!μl磷酸盐缓冲液(PBS)。术后3周取出椎间盘,免疫组织化学方法观察椎间盘髓核细胞中Ⅰ型、Ⅱ型胶原的表达情况,并用VIDAS图像分析系统进行半定量分析。结果:免疫组织化学染色显示:实验组椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原的表达比对照组低;而Ⅱ型胶原的表达则比对照组高,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:体内转染腺病毒介导的hTGF-β1基因能降低椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原的表达、提高Ⅱ型胶原的表达,提示hTGF-β1可以抑制椎间盘的退变。

人转化生长因子β_1重组腺病毒转染传代髓核细胞对细胞外基质合成的影响

目的探讨人转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)对传代羊髓核细胞的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和DNA合成调节因子的作用。方法取1岁龄成年山羊腰椎间盘,体外分离培养羊髓核细胞,传至第3代后以携人TGF-β1(human TGF-β1,hTGF-β1)或lacZ基因的复制缺陷型腺病毒(Ad/hTGF-β1及Ad/lacZ)感染,分别为实验组和阴性对照组;未加病毒液的细胞为空白对照组;原代髓核细胞为原代组。然后继续单层或藻酸钙凝胶三维(3-D)培养10d。对两种系统培养的细胞分别行DNA荧光定量、Western blot分析和蛋白多糖(glycosaminoglycan,GAG)定量检测。结果DNA荧光定量显示,单层培养时实验组细胞的DNA合成显著高于两对照组(P<0.05),藻酸钙凝胶3-D培养各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot检测hTGF-β1、型胶原、型胶原和Aggrecan的表达显示,两种培养系统中,实验组hTGF-β1、型胶原和Aggrecan的表达均显著高于两对照组(P<0.05),型胶原的表达显著低于两对照组(P<0.05),实验组型胶原/型胶原比值较两对照组显著增高(P<0.05)。GAG定量结果显示,两种培养系统中实验组细胞的GAG合成均显著高于两对照组(P<0.05)。结论hTGF-β1在很大程度上可起到维持髓核细胞表型,并在细胞传代后仍发挥表型的调节作用。通过基因工程方法使髓核细胞表达hTGF-β1,有望遏制、甚至逆转椎间盘退变;而以Ad/hTGF-β1感染过的髓核细胞,在藻酸钙凝胶3-D培养系统中培养则表现出原始表型。

重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7转染犬髓核细胞及其对髓核细胞表型的影响

目的:观察重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7(recombinant adeno-associated virus-2expressinghuman bone morphogenetic protein-7,rAAV2-hBMP7)转染犬髓核细胞情况及其对细胞表型的影响。方法:用1岁龄Beagle犬L4/5椎间盘髓核进行髓核细胞体外培养,取第2代髓核细胞进行实验,实验组以rAAV2-hBMP7(1×105v.g/细胞)转染髓核细胞,对照组以重组2型腺相关病毒-增强型绿色荧光蛋白(recombinantadeno-associated virus-2expressing enhanced green fluorescent protein,rAAV2-EGFP)转染髓核细胞。在转染后4d、7d和14d以PCR检测髓核细胞中hBMP7的mRNA表达,在转染后7d和14d以Western blot法检测髓核细胞中hBMP7蛋白表达。在转染后4d、7d和14d采用RT-PCR法检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的mRNA含量,采用二甲基蓝及ELISA法分别检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的蛋白含量。结果:实验组髓核细胞表达hBMP7 mRNA及蛋白,并于转染后7d时表达量最高,而对照组无表达。实验组髓核细胞蛋白多糖mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d时亦明显升高(P<0.05),对照组各时间点无统计学差异(P>0.05);4d时实验组与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P<0.05)。同组各时间点Ⅰ型胶原mRNA及蛋白含量均无统计学差异,两组各时间点间比较无统计学差异(P>0.05)。实验组髓核细胞Ⅱ型胶原mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d亦明显升高(P<0.05),对照组各时间点无统计学差异(P>0.05);实验组4d时与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P<0.05)。结论:rAAV2-hBMP7转染犬髓核细胞后能表达hBMP7蛋白,并能提高其蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量。

核转染技术转染人外周血淋巴细胞效率的初步研究

目的探索核转染技术转染人外周血淋巴细胞的转染效率。方法利用核转染方法将携带增强型绿色荧光蛋白基因的质粒转染人外周血淋巴细胞,24小时后经流式细胞仪检测绿色荧光蛋白EGFP表达水平,确定转染效率。结果未经任何刺激的外周血淋巴细胞转染效率为8.7%,经抗CD3抗体OKT3和抗CD28抗体共同刺激后的外周血淋巴细胞转染效率为10.5%,经抗CD3抗体OKT3和IL-2共同刺激后的外周血淋巴细胞转染效率为9.9%。结论核转染方法是一种转染人外周血淋巴细胞的有效方法,转染前细胞是否受到刺激激活,对转染的效率影响不大。

核转染对成体骨髓源性干细胞的影响

背景:成体骨髓源性干细胞是实施细胞治疗的重要细胞来源。对成体骨髓源性干细胞的示踪,是研究其移行、分化的规律与机制并进一步阐明再生潜能、疗效的关键。目的:探讨经转染后的成体骨髓呈克隆样干细胞,在细胞表型、增殖能力、心肌分化潜能是否存在的影响。方法:应用核转染技术利用U-23程序将编码maxGFP报告基因的载体对成体骨髓呈克隆样干细胞进行转染,应用MTT法对核转染前后的生长曲线进行测定,使用3μmol/L5-氮胞苷对核转染前后成体骨髓呈克隆样干细胞进行向心肌分化诱导,并利用RT-PCR对向心肌分化的特异性标记物GATA4与MLC-2v的表达进行测定。使用成年SD大鼠心肌梗死左前降支结扎模型,对使用经maxGFP转染的成体骨髓呈克隆样干细胞施心内注射并于注射后的第2天和第7天对经注射心脏行冰冻切片并观察maxGFP在体内的表达情况。结果与结论:经核转染24h后,第47代及第119代成体骨髓呈克隆样干细胞的转染率为49.4%和43.1%,转染后5h,开始出现呈绿色荧光阳性的细胞,经核转染后仍能保持小圆球形、可贴壁、呈克隆样生长。MTT检测结果显示:核转染前后第47代及第119代均具有相似的生长曲线。核转染前第47代及119代细胞平均群体倍增时间分别为8.57,10.28h;核转染后分别为9.42,10.42h,各代前后比较差异无显著性意义(P=0.551,P=0.774)。RT-PCR检测结果显示:核转染前5-氮胞苷处理前后均表达GATA4,处理后MLC-2v条带更强;核转染后5-氮胞苷处理前后均表达GATA4,处理后MLC-2v条带更强,上述2个向心肌分化指标于转染前后变化并不明显。体内实验结果:心内注射经核转染后的成体骨髓呈克隆样干细胞,第2天及第7天可在经注射心肌中发现有少量绿色荧光阳性的细胞。提示,核转染可快速地将外源基因导入细胞,经核转染后的成体骨髓呈克隆样干细胞仍能保持其细胞形态、增殖能力及向心肌分化潜能,然而,经maxGFP基因核转染的成体骨髓呈克隆样干细胞,移植入心肌后只有少数细胞能表达经转染基因。

核受体相关因子1基因转染神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨转染核受体相关因子1(Nurr1)基因的神经干细胞(NSCs)移植至帕金森病(PD)大鼠纹状体后向多巴胺能神经元的分化及对PD大鼠行为的影响。方法应用脑立体定位技术构建单侧PD大鼠模型。将PD大鼠随机分为3组,每组8只。假手术组注射生理盐水,NSCs组移植未转染的NSCs,Nurr1组先将重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1转染NSCs,用RT-PCR方法及免疫荧光染色检测Nurr1基因的表达效果,然后用转染Nurr1基因的NSCs进行移植。细胞用DIL标记后移植至PD大鼠右侧纹状体中,术后2周起用阿朴吗啡诱发旋转试验观测移植后大鼠行为改善情况,12周后用免疫荧光技术检测移植细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果重组质粒转染后Nurr1基因能在NSCs中过表达。移植后假手术组和NSCs组PD大鼠的旋转圈数均无下降趋势,两者差异无统计学意义(P>0.05);NSCs组移植区可见DIL阳性细胞,但TH免疫阳性细胞较少,平均每视野为(3.21±0.40)个;Nurr1组移植后PD大鼠的旋转圈数从第6周开始下降,移植区DIL/TH双标神经元每视野达(9.28±1.09)个。结论 Nurr1基因过表达能诱导NSCs在PD大鼠纹状体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元,并在一定程度上改善大鼠的行为功能。

人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体转染椎间盘正常髓核细胞

背景:椎间盘髓核细胞分离培养困难,老化较快,迫切需要一种标准细胞株用于实验研究。目的:探讨人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体的构建及其转染正常髓核细胞构建永生化细胞的可行性研究。方法:通过目的基因克隆、真核表达质粒中目的基因序列测定、目的基因真核表达质粒的构建、转染人端粒酶反转录酶表达检测等步骤进行实验。结果与结论:构建出人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体,成功转染正常髓核细胞并在细胞中稳定表达。结果表明运用人端粒酶反转录酶转染椎间盘髓核细胞构建永生化细胞是一种可行的方法。

油桐尺蠖核型多角体病毒DNA在3株昆虫细胞系中的转染

使用 DNA 磷酸钙共沉淀方法,把油桐尺蠖核型多角体病毒 DNA 导入3株昆虫细胞株。结果表明,同源细胞株的被转染率显著高于非同源细胞株。用间接免疫酶技术检测细胞中病毒多角体蛋白的存在来确定转染率的方法,可在转染21小时后就获得结果,该方法快速、简便。同时,还研究了吸附时间和病毒 DNA 浓度对转染的影响。

正、反义Heparanase基因荧光真核表达载体的构建及胰腺癌SW1990细胞转染

目的构建正、反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并转染人胰腺癌SW 1990细胞.方法用EcoR I从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoR I酶切位点上,经BamH I酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认.用脂质体法将肝素酶正、反义真核表达载体转染人胰腺癌SW 1990细胞,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果.结果经BamH I酶切后,正义质粒形成5.3 kb和1.7 kb两条DNA片段,反义重组质粒为6.5 kb和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值一致;测序结果进一步确认了方向的正确性.转染成功的胰腺癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光.结论成功构建了人肝素酶正、反义真核表达载体,并成功转染人胰腺癌细胞株SW 1990,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对胰腺癌细胞的转移能力的影响奠定基础.

SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的分化

背景:移植间充质干细胞预防和治疗椎间盘退变是一种可行的方法,将SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞,使其向髓核细胞转化,以期获得更大的髓核诱导和促增殖效应。目的:探讨SOX-9和GDF-5基因共同诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的效果。方法:提取、分离、纯化4周龄新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞分为5组体外诱导其向类髓核细胞分化,分别为未转染组、空载体转染组、SOX-9转染组、GDF-5转染组、共转染组。转染后第14天采用RT-PCR检测SOX-9,GDF-5和Ⅱ型胶原的m RNA表达,免疫组化染色法检测髓核细胞标记物KRT19表达。结果与结论:共转染组SOX-9 m RNA表达高于转染SOX-9组,差异有显著性意义(P<0.05);共转染组GDF-5m RNA表达高于转染GDF-5组,差异有显著性意义(P<0.05)。共转染组Ⅱ型胶原表达高于转染SOX-9组、转染GDF-5组,差异有显著性意义(P<0.05)。SOX-9转染组及GDF-5转染组KRT19呈阳性表达,共转染组呈强阳性表达,可见被转染的骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化,且双基因转染诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的能力和分泌细胞外基质的能力明显高于单基因转染。

Amaxa Nucleofector^(TM)核转染仪转染白血病细胞株L1210

慢性淋巴细胞白血病细胞株L1210是广泛运用于白血病发病机制以及化疗药物研究的细胞模型,但该细胞株与其它悬浮细胞株一样,存在着转染效率低的难题。本研究旨在探讨如何提高L1210细胞株的转染效率。应用报告基因pEGFP并通过Amaxa NucleofectorTM核转染仪的几种转染预设模式转染悬浮L1210细胞,与脂质体Lipofectamine 2000转染进行对比,在荧光倒置显微镜下观察、使用流式细胞术检测转染效率,用台盼蓝排斥实验比较存活率。结果表明:使用核转染仪进行转染在L1210细胞中获得了很高的转染效率,且在一样细胞密度(2×106/ml)和质粒量(10μg)条件下,在24小时后进行比较,核转染仪预设模式A-20转染效率达(61.6%),明显高于其它模式(S-18、T-20),存活率可达50.5%;脂质体转染24小时细胞存活率为88%,但转染效率极低(<1%)。结论:核转染仪转染L1210的效率明显高于脂质体转染方案,其转染效率最高可达61.6%,存活率可达50.5%,此结果可满足科研工作需求。

转染外源性转化生长因子β_1基因对兔髓核细胞凋亡的影响

①目的 探讨转染转化生长因子 β1 (hTGF β1 )基因对兔髓核细胞凋亡的影响 ,为活化椎间盘细胞功能、预防椎间盘组织退变提供依据。②方法 取成年新西兰大白兔 5只 ,将外源性hTGF β1 基因直接注射于L3～ 4椎间隙 ,以注射同样剂量磷酸缓冲液的L4～ 5作为实验对照。术后 3周取出相应椎间盘组织 ,利用TUNEL免疫荧光组织化学方法观察髓核细胞凋亡情况。应用Vidas图像分析系统进行免疫阳性细胞半定量分析。③结果 注射hTGF β1 基因的椎间盘凋亡细胞数明显少于对照组 ,测得OPTDM值分别为 0 .0 0 2± 0 .0 0 1、0 .1 5 9± 0 .0 4 1 ,二者差异有显著性 (t=2 7.83,P <0 .0 1 )。④结论 转染hTGF β1

采用核转染技术建立稳定表达可溶性人类白细胞抗原G_1的真核细胞系

目的建立稳定表达可溶性人类白细胞抗原G1(solublehumanleucocyteantigenG1,sHLA-G1)的真核细胞系。方法采用核转染技术将质粒pcDNA3-sHLA-G1转入不表达HLA-类分子的LCL721.221细胞,经G418筛选获得稳定转染细胞,通过RT-PCR及Dot-ELISA在基因和蛋白水平鉴定目的基因的表达。结果采用核转染法LCL721.221细胞转染效率可以达到约14%。RT-PCR检测发现了sHLA-G1基因特异性条带;采用Dot-ELISA方法利用sHLA-G1特异性抗体MEM-G/9检测,存在sHLA-G1蛋白。结论通过核转染方法成功建立了稳定表达sHLA-G1的真核细胞系。

密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2。方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR-XL-TO-PO载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2;通过水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达。结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcD-NA3.1-L1-IRES-L2构建正确。重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录。重组质粒转染293T细胞后出现CPE(cytopathic effect)现象,表明衣壳基因在细胞中已表达。Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达。结论:成功地构建了pcDNA3.1-L1-IRES-L2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础。

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肺癌细胞转染

目的 :构建正义和反义人肝素酶与绿色荧光蛋白真核共表达载体 ,并分别转染人低转移肺癌细胞株 95C及高转移细胞株 95D .方法 :采用基因重组技术 ,用EcoRⅠ从pcD NA3 Hpa质粒上切下约 1 .7kb的人肝素酶全长cDNA片段 ,然后连入pIRES2 EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上 ,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体 ,并用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肺癌细胞株 95C、反义真核表达载体转入人高转移肺癌细胞株 95D ,G4 1 8筛选后 ,荧光倒置显微镜检测转染结果 .结果 :经BamHⅠ酶切后 ,正义质粒形成 5 .3+1 .7kb两条DNA片段 ,而反义重组质粒为 6 .5和 0 .5kb两条DNA片段 ,与理论计算值完全一致 ;转染后肺癌细胞倒置荧光显微下呈绿色荧光 .结论 :成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体 ,并成功转染人低、高转移肺癌细胞株 ,为进一步研究正。

重组质粒介导hTGF-β1基因在体转染模型动物椎间盘髓核细胞的表达

目的观察以质粒为载体的外源治疗基因pACCMV-hTGF-β1在体转染模型动物腰椎间盘髓核细胞后的表达。方法将扩增后的重组质粒基因注射于模型动物的腰椎间盘髓核细胞中,手术后不同时间取出椎间盘,用免疫组织化学方法对椎间盘髓核细胞进行基因表达产物的测定;并利用CMIAS图像分析系统进行半定量观察。结果免疫组织化学染色显示注射pACCMV-hTGF-β1椎间盘,4d组即呈现阳性颗粒,阳性表达可持续至少2周,实验对照组阳性表达仅维持3d,空白组呈阴性反应。结论椎间盘髓核作为靶细胞能够被外源基因转染,并且能在相当长时间内表达TGF-β1蛋白。