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核输入蛋白α/β真核表达载体的构建及细胞内定位 被引量:1
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作者 罗晓丽 周蕾 +8 位作者 丁丽华 张亚楠 刘婕 贾晓蒙 陈滢洁 熊加秀 陈志达 叶棋浓 赵丽纯 《生物技术通讯》 CAS 2015年第6期772-775,共4页
目的:构建带有myc标签的核输入蛋白(importin)α/β的真核表达载体,转染人胚肾293T细胞并分析其表达。方法:以乳腺癌文库为模板PCR扩增核输入蛋白α/β基因,扩增产物插入真核表达载体p XJ-40-myc,经双酶切和测序鉴定;将空载体与重组质... 目的:构建带有myc标签的核输入蛋白(importin)α/β的真核表达载体,转染人胚肾293T细胞并分析其表达。方法:以乳腺癌文库为模板PCR扩增核输入蛋白α/β基因,扩增产物插入真核表达载体p XJ-40-myc,经双酶切和测序鉴定;将空载体与重组质粒分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和免疫荧光技术检测核输入蛋白α/β的表达。结果:酶切鉴定与测序结果表明构建的myc-Importinα/β真核表达载体正确;Western印迹检测到重组质粒在293T细胞中的表达;免疫荧光检测到核输入蛋白α定位于细胞质和细胞核,而核输入蛋白β定位于细胞核。结论:构建了核输入蛋白α/β的真核表达载体,并确定了其在细胞中的表达定位。 展开更多
关键词 核输入蛋白α/β 克隆 细胞定位
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突变A53Tα-synuclein基因核输入信号和核输出信号真核载体的构建及表达分析
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作者 王颖 钱进军 +4 位作者 赵康仁 马瑞 徐敏芳 熊御云 高静 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期618-620,共3页
目的:构建真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES,瞬时转染SH-SY5Y细胞。方法:PCR扩增法获得含有SalI和NotI的目的片段A53T-SNCA-NLS、A53T-SNCA-NES,SalI、NotI双酶切载体pRK5,线性pRK5与目的片段经ligation high连接,... 目的:构建真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES,瞬时转染SH-SY5Y细胞。方法:PCR扩增法获得含有SalI和NotI的目的片段A53T-SNCA-NLS、A53T-SNCA-NES,SalI、NotI双酶切载体pRK5,线性pRK5与目的片段经ligation high连接,酶切、PCR鉴定重组质粒pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES。重组质粒通过Lipofactamine2000转染SH-SY5H细胞,免疫荧光法鉴定瞬转细胞。结果:真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES构建成功,NLS、NES能介导突变基因A53T-SNCA翻译的α-synuclein蛋白在核内表达或胞质表达。结论:基因A53T-SNCA翻译的突变α-synuclein蛋白核内高表达或胞质高表达可能是家族性帕金森氏病发病机制中关键因素之一。 展开更多
关键词 pRK5 核输入信号 输出信号
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病毒蛋白的核输入过程:抗HIV-1药物研究的新靶点 被引量:1
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作者 田野 展鹏 刘新泳 《中国药物化学杂志》 CAS CSCD 2012年第2期131-141,共11页
核输入是HIV-1生命周期中的关键步骤,主要指HIV-1的整合前复合体(PIC)及病毒辅助蛋白通过核孔蛋白复合物进入到细胞核的过程。HIV-1的PIC包含了病毒的基质蛋白、整合酶、病毒蛋白R、cDNA以及多种细胞辅助因子,如晶状体上皮细胞衍生生长... 核输入是HIV-1生命周期中的关键步骤,主要指HIV-1的整合前复合体(PIC)及病毒辅助蛋白通过核孔蛋白复合物进入到细胞核的过程。HIV-1的PIC包含了病毒的基质蛋白、整合酶、病毒蛋白R、cDNA以及多种细胞辅助因子,如晶状体上皮细胞衍生生长因子(LEDGF/p75)、输入蛋白α和转运蛋白SR2。因此HIV-1核输入是一个多因子参与的复杂过程,依赖于PIC成分或单独HIV-1蛋白与细胞核输入因子之间的蛋白质-蛋白质相互作用。相对于传统的抗HIV治疗方法(如靶向于逆转录酶、整合酶、蛋白酶等),针对核输入过程的治疗有可能成为一种新的选择。目前,作用于核输入过程的抗HIV药物研发主要基于两种途径:将功能蛋白的关键区域直接衍生或经修饰而得到具有抑制活性的多肽;基于蛋白质-蛋白质相互作用的具体模式进行合理设计,或通过筛选发现小分子抑制剂。本文综述了关于HIV PIC核输入机制、核输入过程中的关键因子,以及有抑制作用的多肽和小分子化合物的研究进展。 展开更多
关键词 HIV-1 核输入过程 整合前复合体 抑制剂 靶点
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原型泡沫病毒Bel1蛋白核定位信号精细定位及相互作用核输入蛋白初探
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作者 马庆林 于淼 +2 位作者 罗迪 谈娟 乔文涛 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期346-352,共7页
Bel1是原型泡沫病毒(Prototype foamy virus,PFV)的反式激活因子,在病毒的复制周期中发挥关键作用。研究表明,Bel1含有核定位信号(Nuclear localization signal,NLS),但其精确氨基酸组成尚不明确,介导其入核的核输入蛋白亦未见报道。本... Bel1是原型泡沫病毒(Prototype foamy virus,PFV)的反式激活因子,在病毒的复制周期中发挥关键作用。研究表明,Bel1含有核定位信号(Nuclear localization signal,NLS),但其精确氨基酸组成尚不明确,介导其入核的核输入蛋白亦未见报道。本研究利用插入Bel1截短片段的EGFP-GST融合表达体系,通过绿色荧光观察其亚细胞定位,首次精确确定Bel1NLS序列为215PRQKRPR221;定点突变明确了K218、R219和R221为Bel1核定位的必需残基,证明Bel1NLS属单分型核定位信号;GST-Pulldown实验显示这段序列可与α核输入蛋白(Importinα/Karyopherin alpha,official symbol:KPNA)KPNA1、KPNA6和KPNA7相互作用,即Bel1可能藉此转运入核。 展开更多
关键词 Bel1 定位信号 α核输入蛋白
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核输入受体蛋白在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达
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作者 罗筱筱 袁瑞 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第8期1023-1029,共7页
目的探讨核输入受体蛋白13(Importin 13,IPO13)在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达及其临床意义。方法随机选取20份正常增殖期子宫内膜和20份正常分泌期子宫内膜标本为对照组A、B,20例子宫内膜异位症和20例子宫内膜癌患者的子宫内膜... 目的探讨核输入受体蛋白13(Importin 13,IPO13)在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达及其临床意义。方法随机选取20份正常增殖期子宫内膜和20份正常分泌期子宫内膜标本为对照组A、B,20例子宫内膜异位症和20例子宫内膜癌患者的子宫内膜标本为实验组C、D。采用免疫组化法检测IPO13在各组中是否表达;免疫荧光法检测IPO13和干/祖细胞标记在各组中的共表达;荧光定量PCR法检测各组中IPO13基因mRNA转录水平;Western blot法检测IPO13蛋白在各组中的表达水平。结果 IPO13在各组子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的胞浆及胞核中均有表达。对照组B的IPO13阳性细胞数明显低于对照组A和实验组(P<0.01)。IPO13与CD34、CD45、端粒酶、OCT4、C-KIT、PDGF-Rβ、CD90和CD146共表达于各组子宫内膜的上皮细胞和间质细胞;实验组及对照组A的IPO13基因mRNA和IPO13蛋白表达量明显高于对照组B(P<0.01)。结论 IPO13在正常子宫内膜中有表达,且增殖期表达高于分泌期;在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达明显高于正常分泌期子宫内膜,此结果可能与子宫内膜干/祖细胞的表达异常相关;IPO13可作为子宫内膜干/祖细胞的一个候选的标记。 展开更多
关键词 核输入受体蛋白13 成体干细胞标记 子宫内膜异位症 子宫内膜肿瘤
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蛋白质入核转运的机制和研究进展 被引量:14
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作者 周鸣 李小玲 李桂源 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期780-786,共7页
细胞核膜是由外膜和内膜组成的磷脂双分子层结构,同时镶嵌一些核孔复合体(NPC).核孔复合体是胞浆和胞核之间主动和被动转运的生理屏障.核内功能蛋白在胞浆内合成后通过核孔复合体进入胞核,这个过程除了需要NPC上核孔蛋白、胞浆内核转运... 细胞核膜是由外膜和内膜组成的磷脂双分子层结构,同时镶嵌一些核孔复合体(NPC).核孔复合体是胞浆和胞核之间主动和被动转运的生理屏障.核内功能蛋白在胞浆内合成后通过核孔复合体进入胞核,这个过程除了需要NPC上核孔蛋白、胞浆内核转运受体和RanGTP等蛋白的参与外,货物蛋白本身的结构特征在其入核转运过程中亦发挥重要作用.本文着重就蛋白入核转运的机制及近年来取得的相关进展进行综述. 展开更多
关键词 蛋白质 孔复合体 核输入
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重组人Importin α的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 被引量:1
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作者 周杰 杨雨晗 +1 位作者 张琴 张涛 《成都医学院学报》 CAS 2010年第3期242-246,共5页
目的重组表达人细胞核输入蛋白α(Importin α),制备多克隆抗体。方法提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RT-PCR法扩增Importin α基因。构建pGEX-6P-1-Importin α融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表... 目的重组表达人细胞核输入蛋白α(Importin α),制备多克隆抗体。方法提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RT-PCR法扩增Importin α基因。构建pGEX-6P-1-Importin α融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-Importin α重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果 RT-PCR扩增出的Importin α基因片段(1300bp)与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GST-Importin α重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。 展开更多
关键词 核输入蛋白α 表达 蛋白质纯化 抗体制备
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NLS-RARα通过与importin α1/β1(KPNA2/KPNB1)结合入核并抑制U937细胞分化 被引量:1
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作者 叶娇 刘北忠 +9 位作者 李健 熊玲 余莉华 但文冉 刘冬冬 姚娟娟 袁桢 钟鹏强 刘俊梅 钟梁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期499-506,共8页
目的探究核定位信号-维甲酸受体α(NLS-RARα)异常的核定位对细胞分化的抑制作用以及其核转运机制。方法过表达带有血凝素(HA)标签的NLS-RARα慢病毒和空载体慢病毒转染HEK293T细胞和U937细胞,设为NLS-RARα过表达组(NR组)和阴性对照组... 目的探究核定位信号-维甲酸受体α(NLS-RARα)异常的核定位对细胞分化的抑制作用以及其核转运机制。方法过表达带有血凝素(HA)标签的NLS-RARα慢病毒和空载体慢病毒转染HEK293T细胞和U937细胞,设为NLS-RARα过表达组(NR组)和阴性对照组(NC组)。提取HEK293T细胞与U937细胞NC组和NR组细胞核和细胞质蛋白,Western blot法检测NLS-RARα的定位。同时采用免疫荧光细胞化学染色检测NLS-RARα的定位情况。1α,25-二羟维生素D3(1,25D3)诱导U937细胞分化,实时定量PCR,Western blot法检测细胞CD11b、CCAAT/增强子结合蛋白β(CEBPβ)在mRNA和蛋白水平,采用质谱和免疫共沉淀技术(CoIP)筛选与NLS-RARα相作用的转运蛋白,并且通过小干扰RNA(siRNA)转染验证其对NLS-RARα的核定位作用。结果NLS-RARα主要位于细胞核中。与对照组相比,过表达NLS-RARα组CD11b和CEBPβ的增加减少,说明NLS-RARα对1,25D3诱导的细胞分化有抑制作用。质谱和CoIP结果发现核转运蛋白α2/输入蛋白α1(KPNA2/importinα1)和核转运蛋白β1/输入蛋白β1(KPNB1/importinβ1)与NLS-RARα有相互作用,敲低KPNA2/KPNB1则抑制NLS-RARα入核。结论NLS-RARα通过结合KPNA2/KPNB1入核,抑制U937细胞分化。 展开更多
关键词 定位信号 维甲酸受体α(RARα) 细胞分化 转运蛋白α2/输入蛋白α1(KPNA2/importinα1) 转运蛋白β1/输入蛋白β1(KPNB1/importinβ1)
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Cluster Growth Through Monomer Adsorption Processes
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作者 柯见洪 林振权 陈效双 《Communications in Theoretical Physics》 SCIE CAS CSCD 2010年第2期291-297,共7页
We propose a monomer adsorption model, in which only the monomers are allowed to diffuse and adsorb onto other clusters. By means of the generalized rate equation we investigate the kinetic behavior of the system with... We propose a monomer adsorption model, in which only the monomers are allowed to diffuse and adsorb onto other clusters. By means of the generalized rate equation we investigate the kinetic behavior of the system with a special rate kernel. For the system without monomer input, the concentration aj(t) of the Aj clusters (j 〉 1) asymptotically retains a nonzero quantity, while for the system with monomer input, it decays with time and vanishes finally. We also investigate the kinetics of an interesting model with fixed-rate monomer adsorption. For the ease without monomer source, the evolution of the system will halt at a finite time; while the system evolves infinitely in time in the case with monomer source. Finally, we also suggest a connection between the fixed-rate monomer adsorption systems and growing networks. 展开更多
关键词 kinetic behavior ADSORPTION rate equation approach
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核定位信号的研究进展
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作者 刘朝晖 邵宁生 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2003年第3期216-219,共4页
核定位信号 (nuclearlocalizationsignal,NLS)是一种存在于细胞内许多蛋白质中、并介导蛋白质由细胞质向细胞核内转运的氨基酸序列。此氨基酸序列具有多样性 ,其作用机制也各有不同。它的核输入 (nuclearimport)作用受多种因素的调节。... 核定位信号 (nuclearlocalizationsignal,NLS)是一种存在于细胞内许多蛋白质中、并介导蛋白质由细胞质向细胞核内转运的氨基酸序列。此氨基酸序列具有多样性 ,其作用机制也各有不同。它的核输入 (nuclearimport)作用受多种因素的调节。目前 。 展开更多
关键词 定位信号 核输入
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