核运输因子2在糖尿病大鼠视网膜的时空表达及其意义

目的:探讨糖尿病大鼠视网膜中核运输因子2(NTF2)的时空表达变化及意义。方法:伊凡思蓝(EB)灌注铺片观察糖尿病大鼠视网膜血管分布和形态。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测与糖尿病大鼠不同时点鼠龄匹配的对照组(N2w,N1m,N3m,N6m)和糖尿病成模后2周、1月、3月、6月(D2w,D1m,D3m,D6m)大鼠视网膜中NTF2、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达。免疫组化法检测NTF2蛋白在视网膜中的表达和分布位置。结果:正常组大鼠可见在低背景荧光下视网膜血管对EB有很好的屏障作用,成模1月后糖尿病大鼠视网膜血管仅见背景荧光增强,成模3月后血管出现异常节段性扩张,局部血管周围EB渗漏。与糖尿病大鼠年龄匹配的正常大鼠视网膜NTF2和VEGF并未随时间延长而变化,mRNA表达稳定。糖尿病成模2周后开始,NTF2mRNA有轻度增高,并随病程的延长保持较高水平,病程达6个月时,NTF2表达开始回落,与正常大鼠基本一致。NTF2蛋白在正常大鼠及糖尿病大鼠视网膜中免疫组化均可以检出,主要分布在视网膜内层,以节细胞层、内核层为主。结论:NTF2mRNA水平在糖尿病大鼠视网膜中升高,主要分布在视网膜内层。NTF2很可能在糖尿病视网膜病变中起着一定的调控作用,其作用途径及机制可能与VEGF的作用通路有一定的联系。

重组AAV2-NTF2对人视网膜微血管内皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响

目的观察核运输因子2(NTF2)在体外培养的人视网膜微血管内皮细胞(RCECs)中的表达,并探讨其高表达对RCECs中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法取中山眼科中心眼库的人眼球,分离视网膜组织用以培养人RCECs,并用Ⅷ因子抗体免疫组织化学法鉴定。免疫组织化学法观察细胞中NTF2的表达。通过重组腺相关病毒(rAAV2)将外源性NTF2导入培养的RCECs内,rAAV2-NTF2和rAAV2-EGFP转染RCECs,未转染组为对照组。激光共焦显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)阳性细胞,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组NTF2、VEGFmRNA的表达变化,并进行定量分析。结果培养的RCECs呈典型铺路石样排列,荧光显微镜下可见Ⅷ因子阳性表达为绿色荧光,95%以上的活体细胞可摄取DiI标记的Ac-LDL,并在荧光显微镜下呈现红色荧光。RCECs可表达NTF2,主要位于细胞质内,富集于核周。rAAV2-EGFP转染后,激光共焦显微镜观察可见大量EGFP阳性细胞,实验组NTF2在mRNA水平表达明显强于GFP组和对照组(t=15.06,t=7.02,P<0.01),VEGF表达明显下降(t=7.40,t=14.08,P<0.01)。结论 rAAV2-NTF2转染视网膜内皮细胞后,NTF2可稳定高表达,VEGF表达下降,NTF2可能通过调节VEGF的表达参与新生血管的发生。

rAAV2-NTF2对糖尿病大鼠血视网膜屏障的保护作用

目的:观察2型重组腺相关病毒-核运输因子2(rAAV2-NTF2)对糖尿病大鼠血视网膜屏障功能损伤的拮抗作用。方法:伊凡思蓝(EB)灌注铺片观察糖尿病大鼠视网膜血管分布和形态。亚克隆构建pSNAV-NTF2载体,腺相关病毒包装形成rAAV2-NTF2。成年雄性Wistar大鼠,以右眼为实验眼,玻璃体腔注射4μLrAAV2-NTF2,左眼为对照眼,玻璃体腔注射rAAV2-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)4μL。1个月后取4只大鼠左眼,固定后取视网膜制备全视网膜铺片,荧光显微镜下观察EGFP表达情况。再行STZ腹腔注射诱导糖尿病,同时设单纯糖尿病组(diabetes,D组)和正常组(normal,N组)。糖尿病1个月后以45 mg/kg剂量静脉注射EB,循环2 h后1%多聚甲醛枸橼酸缓冲液灌注并摘除眼球取视网膜,置于甲酰胺中浸泡提取染料,用分光光度计测量甲酰胺中染料的浓度。结果:正常组大鼠可见在低背景荧光下视网膜血管对EB有很好的屏障作用,糖尿病2周大鼠视网膜血管仅见背景荧光增强,糖尿病1月后血管出现异常节段性扩张,局部血管周围EB渗漏。糖尿病1个月大鼠视网膜内EB浓度是正常组的4.67倍,P<0.01,提示糖尿病大鼠血-视网膜屏障受损。玻璃体腔注射rAAV2-NTF2,视网膜内EB浓度为(8.30±4.16)μg/g视网膜干重,较对侧眼(22.13±8.43)μg/g视网膜干重明显减少,可以部分改善血-视网膜屏障的破坏,降低EB-白蛋白渗漏(P<0.05)。结论:玻璃体腔注射rAAV2-NTF2可减轻糖尿病大鼠视网膜血-视网膜屏障功能的破坏,为糖尿病视网膜病变的基因治疗提供了实验依据。