核酸依赖性扩增技术研究现状及展望

自19世纪90年代以来,等温核酸扩增技术及其衍生技术迅速发展。等温核酸扩增技术的流程简易、成本和应用要求更低,应用前景广泛。其中,核酸依赖性扩增技术(NASBA)已广泛用于病原体检测、单核苷酸突变检测和环境监测等领域。本文主要对近5年来NASBA技术的研究进展及其在分子诊断中的应用进行综述,探讨NASBA技术的前景与瓶颈。

核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)概述

随着分子牛物学技术的快速发展,体外核酸扩增技术己逐步应用于科研和临床.最近几年才兴起的核酸序列依赖性扩增法(Nuleic and sequerce based amplipicain,NASBA)同传统的实验方法相比有灵敏性高,特异性强,快速,高通量等优点,而倍受中外学者的青睐.本文就NASBA方法作一综述.……

核酸序列依赖性扩增、Real-time PCR及GM试验诊断侵袭性曲霉菌感染的临床应用评价

目的核酸序列依赖性扩增（nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）、Real-time PCR及GM试验在侵袭性曲霉菌感染中的诊断价值。方法收集2013年11月~2014年6月临床上曲霉菌感染高危病患的血液标本80例,并根据EORTC/MSG诊断标准分为确诊组8例,拟诊组26例,非感染组46例,分别利用NASBA、real-time PCR及GM试验进行检测,计算3种方法的诊断指标并分析评价。结果 NASBA、real-time PCR及GM试验3种方法的灵敏度分别为76.47%、67.65%、52.94%,特异度分别为80.43%、89.13%、80.43%。联合诊断结果显示,NASBA与real-time PCR串联方案有最好的特异度（100%）及阳性预测值（100%）;NASBA与real-time PCR并联方案则最为灵敏（94.12%）。结论 NASBA用于诊断IA最为敏感,而real-time PCR则最为特异,GM试验的表现差于前两者。联合应用的诊断策略,在特定情况下提高临床早期诊断IA的准确性。

基于核酸序列依赖性扩增反应比色法检测沙门氏菌

本文以食源性致病菌中危害居于前列的沙门氏菌侵袭蛋白A基因作为检测靶标,通过改进传统的核酸序列依赖性扩增反应,开发了针对长链DNA的纳米金比色检测方法。本方法利用限制性内切酶和连接酶将T7启动子和终止子序列连接至靶标序列上,形成小型环状双链DNA,在T7 RNA聚合酶的作用下,转录出大量单链RNA序列进行NASBA反应,反应终产物能够促发纳米金探针发生交联聚集,溶液颜色从红色变成蓝色,从而实现对沙门氏菌的定量分析。

基于核酸序列依赖性扩增技术的玉米转基因成分Bar的鉴定

为了开发高灵敏度、高特异性且易于普及的玉米转抗草丁膦抗性Bialaphos resistance(Bar)基因的鉴定方法,采用核酸序列依赖性扩增(Nucleic Acid Sequence-based Amplification,NASBA)技术,根据转基因成分Bar基因的mRNA序列,设计合成Bar基因的检测特异引物和探针,通过优化NASBA扩增反应程序和产物检测体系,开发不依赖核酸扩增仪的转基因成分Bar的分子检测试剂盒,短时间内对转基因成分Bar进行高灵敏度筛查。结果表明,检测特异性好且灵敏度高,其灵敏度可达6 fg,样本检测也说明试剂盒具有较高灵敏度和特异性,且适合基层部门和采样现场对Bar转基因成分的早期鉴定。

一种基于核酸序列依赖性扩增技术的高危型人乳头状瘤病毒E6/E7 mRNA检测方法的建立及应用

目的建立一种高效的基于核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)的检测方法,为人乳头状瘤病毒(HPV)的普查和宫颈癌防治提供快速准确的分子检测方法。方法收集用于宫颈筛查或宫颈细胞学异常的液基细胞学样本406个,采用NASBA技术检测这些样本中的高危型HPV E6/E7 mRNA。通过probit回归分析法预测了14种高危型HPV E6/E7 mRNA的95%检测极限。以5种低危型HPV RNA和8种常见病原体RNA为模板对该NASBA检测方法的特异性进行了评估。结果 406个检测样本中各项检测数据齐全者356个。比较病理诊断、HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA3种方法的检测结果,发现随着病理学级别的升高,高危型HPV DNA感染阳性率呈现明显的上升趋势,且高危型HPV E6/E7 mRNA感染阳性率同样呈现明显的上升趋势。probit回归分析结果显示,HPV16、18、33、35、39、45、56、59、66和68预测的95%检出限都低于100拷贝/反应,HPV31、51、52和58预测的95%检出限介于100~300拷贝/反应之间。5种低危亚型HPV RNA和8种病原体RNA的NASBA检测结果均为阴性,表明该检测方法未检出非特异性扩增。结论该研究建立的检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法,具备很好的敏感性、准确性和特异性,同时它的快速、高通量等特点进一步提高了其在预测宫颈癌患病风险中的临床诊断价值。

建立核酸序列依赖性扩增方法检测寨卡病毒

目的建立检测寨卡病毒的核酸序列依赖性扩增(NASBA)方法,满足口岸需要。方法根据寨卡病毒NS3基因设计并验证特异性扩增引物,建立NASBA方法。用登革病毒、基孔肯雅病毒、乙脑病毒、黄热病毒作为对照验证方法的特异性;用不同浓度寨卡病毒RNA进行NASBA扩增,确定方法的灵敏度。结果以寨卡病毒RNA为模板扩增获得NS3基因片段,序列分析未发现非特异性扩增。建立的NASBA方法只有寨卡病毒出现目的扩增条带,与对照病毒无交叉反应,最低检测限为1.2 pg/μl。结论建立的NASBA方法可以特异、准确地检测寨卡病毒RNA,可用于口岸寨卡病毒监测。

高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒NASBA-ELISA检测方法的建立

针对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF1中编码Nsp2的基因序列设计引物,建立了核酸序列依赖性扩增(NASBA)方法,并结合微孔板中液相杂交和酶标显色反应检测NASBA扩增产物,建立了检测高致病性PRRSV的NASBA-ELISA。琼脂糖凝胶电泳显示,NASBA方法扩增出了特异性的目的条带。将NASBA产物RNA系列稀释后同时进行了ELISA和Northern杂交。结果显示,ELISA和Nor-thern杂交最高可分别检测到1∶50和1∶30稀释的产物RNA。采用建立的NASBA-ELISA可检测到101.83TCID50/mL的HuN4株PRRSV。该方法只对3株高致病性PRRSV的检测结果为阳性,对经典株PRRSV和其他猪源病毒的检测结果均为阴性。结果表明,NASBA-ELISA能够敏感并特异地检测高致病性PRRSV。

基于NASBA技术的鹿结核分枝杆菌鉴定方法研究

为了开发高灵敏度、高特异性且易于普及的鹿结核分枝杆菌的鉴定方法,试验采用核酸序列依赖性扩增（NASBA）技术对引起鹿结核病的常见两种病原体的灵敏度和特异性进行检测,开发出不依赖核酸扩增仪的结核病病原体TB-NASBA分子诊断试剂盒,并用该试剂检测临床样本,同时测定了试剂盒的稳定性、保存期。结果表明：TB-NASBA试剂盒检测灵敏度高且特异性好,其灵敏度可达到1 cfu/m L;临床样本检测也证实TB-NASBA试剂盒具有较高的灵敏度和特异性;TB-NASBA试剂盒在4℃条件下可存放1年,室温只能存放半年。说明TB-NASBA试剂盒不但可用于结核病的早期检测,且不依赖大型设备和专业人员的特点,容易普及,适合基层部门对结核病的早期诊断。

NASBA技术在动物疫病检测中的应用

核酸依赖性扩增技术(NASBA)是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。它的特点是:恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。本文就现阶段核酸依赖性扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景作一综述。

猪瘟病毒NASBA-RT-LAMP快速检测方法的建立

本研究基于核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)和反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种针对猪瘟病毒的,快速、灵敏、特异的两步法检测技术。该方法的检测灵敏度与反转录巢式PCR(RT-NestPCR)相当,最低能检测出46 pg/μL的病毒RNA。该方法的建立为猪瘟病毒的快速诊断提供了新思路。

食源性病毒核酸恒温检测技术研究进展

食源性病毒已成为全球引发食品安全事件的重要病原,对新型检测技术的不断发展提出了严峻的挑战。早期PCR技术在病原检测领域中的应用,推动了对食源性病毒的全面认识。近年来核酸恒温检测技术发展迅速,包括环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术、核酸序列依赖性扩增技术、链置换扩增技术、滚环扩增技术等,在抗复杂基质干扰、装备要求低以及可现场实时检测等方面具有明显的技术优势,已成为食源性病毒检测领域的热点研究方向。因此,本文对近年来食源性病毒核酸恒温检测技术的原理、应用、优缺点等方面进行综述,并对未来发展方向进行了展望。

番茄斑萎病毒NASBA检测方法的建立

为建立一种快速检测番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的方法,以TSWV-CP1/TSWV-CP2为引物对TSWV的N基因进行PCR扩增及序列测定,在TSWV N基因的高度保守区设计特异性扩增引物NA-P1/NA-P2进行核酸序列依赖性扩增(NASBA)反应,并对NASBA方法的特异性和灵敏度进行验证。结果表明,建立的NASBA方法最佳反应时间为1.5 h。该方法特异性较好,只有TSWV阳性样品中出现了预期大小为235 bp的扩增产物,与烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus,TRSV)、番茄黑环病毒(Tomato black ring virus,TBRV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow curl virus,ToYCLV)无交叉反应。灵敏度验证中,实时荧光RT-PCR的灵敏度最高,为1.56×10^(-5)ng/μL感病植物RNA模板,NASBA次之,为1.56×10^(-4)ng/μL,普通RT-PCR最低,为1.56×10^(-3)ng/μL。在对9份实际样品检测中,NASBA的阳性检出率与实时荧光RT-PCR、普通RT-PCR相同,均为33%,高于ELISA检测的22%。表明NASBA方法适用于实际样品检测,可对TSWV进行快速检测。

黄瓜花叶病毒NASBA检测技术的建立

以香蕉花叶病病样为材料,初步建立了黄瓜花叶病毒核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence based amplifica-tion,NASBA)的检测技术。通过以香蕉叶片总RNA为模板,在黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)亚组ⅠRNA 2高保守区设计特异引物,进行NASBA反应,经5%琼脂糖凝胶电泳检测,阳性样品中出现了预期大小为310 bp的条带,而阴性和空白对照中均未出现。并对11份香蕉样品分别进行NASBA反应,并经过斑点杂交验证与RT-PCR检测比较,两者的检测结果一致,灵敏度相当,检出限量可达100 pg。

RT-PCR和NASBA方法检测52例HIV/AIDS病人HIV-1 RNA定量结果的比较

1型艾滋病病毒核糖核酸(HIV-1RNA)定量检测,不仅可以预测HIV-1感染者疾病进展、评估抗病毒治疗效果及监测耐药,而且也可作为HIV感染辅助诊断,用于<18月龄婴幼儿的早期诊断、急性期/窗口期及晚期HIV感染者诊断^([1-3])。因此,HIV-1RNA定量是艾滋病防治工作中一项重要的实验室检测指标。

NASBA技术在蚊媒传染病检测中的研究进展

核酸序列依赖性扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)是以PCR为基础发展的恒温扩增技术,操作简单、高保守性、高灵敏度、高特异性、引物设计简单、检测周期短和兼容性强,适用于RNA的扩增,能在2 h将单链RNA扩增约109倍,无需特殊设备。NASBA技术已广泛应用于呼吸道病毒、肠道病毒、食物传播病毒、免疫缺陷病毒和动物源性病毒等病原体的检测。本文就NASBA技术的检测原理、技术特点、扩增产物检测方法以及在蚊媒传染病检测中的应用做一总结。