基于免标记发夹型探针和核酸外切酶Ⅲ的荧光信号放大DNA检测

设计合成了一种长臂发夹型核酸探针,结合核酸外切酶Ⅲ水解反应建立了一种免标记荧光信号放大高灵敏检测DNA的新方法。当不存在靶DNA时, SYBR Green Ⅰ荧光染料能够嵌入发夹型探针的茎部而发出很强的荧光,而当存在靶DNA并与发夹型探针杂交后,核酸外切酶Ⅲ从杂交产物的3’端开始水解发夹型探针,释放出靶DNA,并触发下一个酶水解反应,同时SYBR Green Ⅰ染料也随发夹型探针水解而释放,导致荧光信号降低,从而实现了对DNA的免标记荧光信号放大高灵敏检测。该方法的检出限低至320 fmol/L,比传统双标的分子信标的方法降低了4~5个数量级,且该方法还具有免标记、简单、快速的特点。

基于核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大与MoS2纳米片荧光猝灭性质的核酸检测方法

将核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大技术与Mo S_2纳米片的荧光猝灭性质结合,构建了一种高灵敏高选择性的DNA检测方法。首先设计两条末端修饰荧光基团的探针核酸(HP1和HP2)。由于两条探针核酸具有3'粘性末端,使其不会被核酸外切酶Ⅲ降解,因而被吸附于Mo S_2纳米片而猝灭其荧光。当目标DNA存在时,会促使核酸外切酶Ⅲ启动双重信号放大反应,并将探针核酸降解成大量的不能吸附于Mo S_2纳米片表面的荧光碎片。在优化条件下,目标DNA浓度在0.5~6.0 pmol/L范围内与荧光信号变化呈良好的线性关系,检出限为0.28 pmol/L。与单重信号放大技术相比,本方法极大改善了分析灵敏度和检出限,且具有良好的单碱基错配区分能力。

基于核酸外切酶Ⅲ辅助双循环等温信号放大的高灵敏Hg^(2+)传感方法研究

设计了一种Hg^(2+)触发的核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助的双发夹探针双循环等温信号放大策略,在此基础上发展了一种免标记、超灵敏的Hg^(2+)生物传感器。在Hg^(2+)存在情况下,发夹探针1的3'游离序列与汞离子识别探针通过T-Hg^(2+)-T配位结合形成双链DNA平末端,核酸外切酶ExoⅢ能识别双链DNA平末端并沿3'-5'方向催化水解茎部序列。释放的Hg^(2+)和识别探针进入新一轮反应循环(循环1);释放的发夹探针1未降解序列包含Ⅰ区序列和G-四链体形成序列,其中,Ⅰ区序列与发夹探针2的3'游离序列(Ⅰ~*区序列)完全互补,引发了ExoⅢ参与的双链DNA平末端水解,释放的Ⅰ区序列进入新一轮反应循环(循环2)。循环1和2为自发循环过程,经过多次循环可以产生大量单链的G-四链体序列。体系中加入氯化血红素,与G-四链体结合形成G-四链体-血红素-DNA酶,催化ABTS-H_2O_2反应体系显色。考察了多种因素对检测体系的影响,在最优实验条件下,此方法对Hg^(2+)的线性检测范围为0.3～50 pmol/L,检出限为0.25 pmol/L(S/N=3),回归方程为ΔA_(420 nm)=0.117+0.004C_(Hg^(2+))(pmol/L)。当水样中存在大量其它金属离子时,传感器对Hg^(2+)仍然具有较高的选择性。将此方法应用于环境水体中Hg^(2+)含量检测,加标回收率为96.0%～106.0%。本方法操作简单、选择性好、灵敏度高、有较强的抗干扰性能,可用于环境水样中Hg^(2+)的高灵敏检测。

基于二硫化钨和核酸外切酶Ⅲ的荧光法高灵敏检测血液中汞离子

目的:将信号放大策略用于荧光法实现血液中低浓度汞离子的检测。方法:将汞离子加入到富含胸腺嘧啶且3’端荧光标记的单链DNA溶液中,汞离子介导该特异序列形成分子内的双链结构,且该双链DNA具有3’凹端,因此能够被核酸外切酶Ⅲ水解并释放出荧光标记的单核苷酸,当加入二硫化钨(WS_2)后,荧光标记的单核苷酸不能被二硫化钨吸附从而荧光信号明显增加。对WS_2和ExoⅢ的量进行优化考察,对方法的线性、检测限、特异性等性能进行验证。3个不同浓度汞离子在血浆样品中的加样回收率也进行验证。结果:汞离子在1～30 nmol·L^(-1)和30～250 nmol·L^(-1)范围内线性关系良好,r分别为0.993 6和0.995 2,检测限为0.1 nmol·L^(-1),加样回收率分别为110.0%,116.0%,90.9%,RSD分别为16.5%,18.7%,17.8%(n=6)。结论:建立的荧光法可以实现血液中低含量汞离子的检测,为临床上检测汞离子提供一种新方法。

核酸外切酶Ⅲ消化双链DNA的缺失测定

测定了 ＥＸＯ Ⅲ在单位时间内所消化双链 ＤＮＡ的碱基对数，即缺失测定．

基于核酸外切酶Ⅲ降解原理荧光检测乙肝病毒HBV

利用核酸外切酶Ⅲ降解杂交的DNA链,将荧光素修饰的DNA探针释放到溶液中,通过测定溶液的荧光强度来测定乙肝病毒(HBV)的浓度。考察了缓冲溶液的种类、pH值、反应时间等对反应体系荧光强度的影响,确定了最佳反应条件:最佳缓冲溶液为TT缓冲溶液(pH8.0,250 mmol.L-1Tris-HCl,体积分数0.1%Tween 20),缓冲溶液的最佳pH值为9.0,生物素与亲和素最佳结合时间为25 min,DNA的最佳杂交时间为20 min,酶反应最佳时间为1.1 h。在最佳反应条件下,随着HBV浓度的增加,体系的荧光强度明显增强。该方法测定HBV的线性范围为0.5～5.0 pmol.L-1,检测限为0.335 pmol.L-1。

基于核酸外切酶Ⅲ信号放大的比率型荧光传感器检测致病菌基因

食源性致病菌严重威胁着公众健康。本研究基于荧光共振能量转移原理,以Cy3和Cy5作为荧光供体和受体基团,利用核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)增强检测信号,构建了比率型荧光传感器,用于高灵敏度检测致病菌基因。分别标记有Cy3的R1-DNA和标记Cy5的R2-DNA形成双链R1/R2,在Cy3的激发光波长激发下,由于发生荧光共振能量转移,Cy3的荧光被猝灭而产生Cy5的荧光信号。致病菌靶基因(大肠杆菌Lac Z基因)的存在可将R1/R2双链解旋,使得Cy3远离Cy5,导致Cy3的荧光恢复而Cy5的荧光信号降低。在ExoⅢ作用下,Cy3与Cy5的信号变化进一步增大。在优化的实验条件下,荧光信号变化与靶基因在10~2000 pmol/L浓度范围内呈现良好的线性关系,检出限为5.29 pmol/L。所采用的比率型信号检测策略极大地降低了假阴性、假阳性检测结果的产生,增强了检测特异性。

一种基于核酸外切酶Ⅲ的PCR产物克隆方法

基因克隆作为一种常规技术被广泛应用于DNA及蛋白质的研究。在传统的基因克隆中,一般利用限制性内切酶对DNA片段进行消化,然后使用DNA连接酶完成连接,因此这种方法受到插入片段和载体酶切位点的限制。一些ligase-free克隆技术虽然克服了酶切位点的限制,但费时费力,成本较高。为了弥补其他ligase-free技术的不足,文中介绍了一种新的利用核酸外切酶Ⅲ进行ligase-free克隆的方法,反应时间仅需要30 min,提高了克隆效率并有效降低经济成本,有利于大规模基因克隆的应用。

基于核酸外切酶Ⅲ信号放大技术的荧光适配体传感器用于卡那霉素的检测

建立了一种基于核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)和碳纳米颗粒(CNPs)的信号放大体系用于卡那霉素(KAN)检测的新方法。合成了水溶性的CNPs,并设计合成了不同序列的DNA,具体包括:卡那霉素适配体(Apt),羧基荧光素标记的信号DNA探针(FAM-DNA)和互补链cDNA。当体系中不存在KAN时,Apt与cDNA可以杂交形成双链DNA,体系中FAM-DNA处于单链状态,Exo Ⅲ不能水解单链DNA;此时,体系中加入CNPs,单链FAM-DNA被CNPs吸附,荧光发生淬灭;在KAN存在下,Apt与其靶标KAN特异性结合,此时FAM-DNA与cDNA杂交形成双链DNA,由于CNPs对双链DNA吸附较弱,DNA探针的荧光不发生淬灭。ExoⅢ可以特异性的从3’-端对FAM-DNA降解,释放FAM荧光团和cDNA,该体系通过"降解-杂交"循环,最终释放出大量的FAM荧光团。由于CNPs对FAM具有较低的亲和力,释放出的FAM不能吸附在CNPs表面,FAM荧光不会发生淬灭,实现荧光信号放大扩增作用。方法线性范围为50~100 nmol/L,检测限为2.5 nmol/L。该方法可用于实际样品牛奶中卡那霉素的检测。

基于核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的荧光法检测四环素

以核酸适配体作为识别单元、核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)作为信号放大元件以及氧化石墨烯(GO)作为信号开关的荧光传感器来检测四环素(TC)。当体系中没有TC存在时,四环素适配体与其互补链(c DNA)杂交形成双链,EXOⅢ不能切割5’端标记有荧光基团的单链信号链(SP),加入GO后,信号链被吸附至GO表面并发生荧光淬灭。当体系中有TC存在时,核酸适配体能够识别并且结合TC,促使c DNA与SP链形成双链,这将诱导EXOⅢ从信号链3’端对c DNA-SP双链进行切割,释放出荧光基团,游离的荧光基团不能被GO吸附而淬灭,通过连续的酶促切割,得到更多的游离荧光基团,从而使得荧光信号明显增强。建立的荧光法对TC具有较高选择性,检测限(LOD)为671 pmol/L,方法已用于自来水样品中TC的测定。

基于核酸外切酶Ⅲ和G-四链体无标记检测Pb^2+的荧光传感器

基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)的水解特性以及Pb^2+诱导富含G碱基的DNA(G-DNA)形成G-四链体结构的特点,以荧光染料SYBR GreenⅠ(SGⅠ)为信号探针,一端带有3’凸末端的线性双链DNA(G-dsDNA)为识别探针,建立了一种新型无标记检测环境样品中Pb2+的荧光传感方法。研究了不同浓度Pb^2+引起体系荧光强度变化的规律,考察了SGⅠ、ExoⅢ的浓度、溶液pH以及稳定时间等因素对检测灵敏度的影响。结果表明:在优化的实验条件下,Pb^2+浓度在2.0~50.0 nmol/L范围内与体系荧光强度的变化呈良好的线性关系,检出限为0.7 nmol/L。常见金属离子对Pb^2+的检测无明显干扰,方法具有良好的选择性。

基于石墨烯猝灭及核酸外切酶辅助循环放大适体传感器检测ATP

基于核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）辅助分析物循环放大原理,结合石墨烯（G）的超高荧光猝灭能力,以三磷酸腺苷（ATP）作为模型分析物,构建了一种新型的荧光探针,实现了ATP的高灵敏检测。两条DNA链各包含一部分ATP适体序列,其中1条DNA链的3＇端修饰有荧光染料异硫氰酸荧光素（FITC）。当模型分析物不存在时,两条DNA链通过非共价π-π堆积作用吸附在G表面,导致FITC的荧光猝灭。当目标物ATP存在时,两条DNA链与目标物ATP进行特异性结合,形成一双链夹心结构,随后加入ExoⅢ,由于ExoⅢ可对该双链夹心结构的3＇凹陷末端进行逐步水解,释放出目标物ATP和游离的FITC。释放出的目标物ATP可继续进入下一循环,不断产生游离FITC,游离FITC将脱离G表面,从而导致体系的荧光恢复,并且恢复的荧光强度与ATP浓度在0.02~1μmol/L范围内存在良好的线性关系,检出限（S/N=3）为9 nmol/L。

基于Exo Ⅲ信号放大的荧光适配体传感器检测Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子

Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子(Kunitz Soybean Trypsin Inhibitor,KTI)是一种很关键的抗营养因子,不仅对动物消化系统和生长发育有不良影响,还制约各个行业对大豆的利用率,因此快速有效的检测方法是非常必要的。该研究建立一种基于核酸外切酶Ⅲ(Exonuclease Ⅲ,Exo Ⅲ)和碳纳米颗粒(Carbon Nanoparticles,CNPs)的信号辅助放大荧光传感体系用于KTI的检测。具体体系包括KTI适配体(Aptamer,APT)、互补链(Complementary DNA,c DNA)、信号探针(Signal Probe,SP)、Exo Ⅲ和CNPs共5个部分。通过可行性分析和CNPs浓度优化试验,测得KTI在100~600 ng/mL范围内呈线性相关,检测限为12.59 ng/mL。以豆浆作为样品,采用加标回收测得回收率为97.42%~102.85%,RSD在0.61%~2.36%之间,该方法可对实际样品中的KTI进行测定。

基于金纳米粒子的DNA探针和ExoⅢ辅助信号放大平台用于HIV-DNA的检测

设计了一种金纳米粒子(AuNP)和核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助靶标循环信号放大的新型纳米探针用于HIV-DNA的检测.该纳米探针由AuNP和捕获探针p1和信号探针p2构成.在靶标HIV-DNA不存在的情况下,此时纳米探针抗ExoⅢ水解,信号探针p2与AuNP之间的距离较近产生荧光共振能量转移,体系的荧光基本被猝灭.但是,在靶标存在的情况下,靶标与信号探针p2杂交,将p1置换下来,此时与靶标杂交的信号探针p2双链体能在ExoⅢ的作用下发生水解,使荧光团释放,体系荧光增强.同时,靶标也被释放并与AuNP上的探针p2作用,以驱动下一个反应,达到靶标循环目的,因此这种方式检测时间较短且稳定性高.该方法的线性范围为100 pmol/L~50 nmol/L,检测限为38.68 pmol/L(信噪比S/N=3).该方法具有良好的抗干扰性,可用于复杂生物样品检测,回收率在98.72%~106.72%之间.

基于酶辅助的比率型电化学适配体传感器用于前列腺特异性抗原检测

基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助靶标循环策略,构建了比率型电化学适配体传感器,并用于前列腺特异性抗原(PSA)的检测。利用亚甲基蓝(MB)作为内置参考信号,当PSA存在时,发夹探针1(HP1)的适配体序列与PSA特异性结合,引起ExoⅢ的2次切割过程,从而实现2次循环扩增反应,导致电极上更多的MB标记的发夹探针3(MB-HP3)被切割;再加入二茂铁(Fc)标记的DNA链(Fc-DNA)与MB-HP3酶切后的片段进行杂交;最终,Fc的信号(I_(Fc))增加,而MB的信号(I_(MB))基本保持不变。在最佳条件下,I_(Fc)/I_(MB)与PSA浓度的对数值在0.001~100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,检出限为0.24 pg/mL。该传感器在临床实际样品检测中具有较好的应用前景。

利用纳米银簇循环放大检测汞离子

通过利用DNA合成的银纳米簇作为荧光探针研究一种新型的检测汞离子的方法。该方法是基于汞离子触发使颈环DNA的颈部形成双链结构,核酸外切酶Ⅲ剪切双链部分释放出DNA单链,该DNA单链能作为模板用于形成荧光银纳米簇,该传感器的荧光信号与汞离子的浓度有关。释放的汞离子可以继续参与循环,进一步放大检测信号。汞离子检测的线性范围是3.0×10-11到3.0×10-8 mol·L-1,该传感器的灵敏度较高。该方法是对汞离子的特异性检测,不受其他离子的影响,并可用于实际样品的检测。

基于氧化石墨烯和三链DNA的三聚氰胺检测研究

发展成本低、准确度高、特异性好的三聚氰胺检测方法具有重要的研究意义。基于氧化石墨烯(GO)自身较好的荧光猝灭性能,结合含脱碱基位点的三链DNA和核酸外切酶Ⅲ的特殊性能,构建了一种高灵敏的特异性三聚氰胺检测新方法。首先制备了GO,并采用紫外-可见吸收光谱仪、傅里叶红外吸收光谱仪及透射电子显微镜对其进行了表征。在最佳的实验条件下,考察了设计方法对三聚氰胺的检测灵敏度和特异性。结果显示,体系荧光强度与三聚氰胺浓度呈现较好的线性关系,线性范围为0.5×10^(-9)~7.0×10^(-9) mol/L,检测限为0.32×10^(-9) mol/L。此外,本方法对奶粉样品中三聚氰胺检测的回收率为92.8%~106.1%,表现出很好的实际应用潜力。

测定重复序列的一种有效方法——定向删除法

基因组中存在大量的重复序列,它们具有调节基因表达和染色体的生理代谢等重要的生物功能。重复序列由于其结构的特殊性,不但鸟枪法基因组测序不能有效地测定它们的序列,而且采用引物步移法等一般的定向测序方法也不能对其准确测定。本研究利用核酸外切酶Ⅲ定向删除技术,结合菌液电泳等快速筛选方法,对黄蜂蜘蛛三个高度重复序列丝蛋白基因MaSp2、CySp1和CySp2进行了准确的测定。研究结果表明核酸外切酶Ⅲ定向删除法是一种测定高度重复序列的有效方法,利用普通的琼脂糖电泳技术,该方法可以单向地有效测定重复序列的长度可达10kb,同时我们还发现合适内切酶的选择,定向删除亚克隆的筛选与排序以及序列的准确拼接是该方法有效而准确测定高度重复序列的关键。

金鱼组织中壬基酚的含量检测新方法探讨

建立一种直接检测环境中痕量壬基酚的外切酶保护-荧光定量PCR方法。首先向含雌激素受体及相关蛋白的细胞溶质中加入壬基酚-丙酮溶液,使受体蛋白活化,从而在体外与含雌激素反应位点的双链结合DNA作用形成壬基酚-雌激素受体-DNA复合物。复合物用核酸外切酶和S1核酸酶消解,去除未受到蛋白质保护的结合DNA。将消解后产物作为模板,进行荧光定量PCR扩增反应,建立壬基酚浓度与标准DNA拷贝数的对数之间的线性关系为：y（壬基酚浓度的对数）=1.637x（标准DNA拷贝数的对数）-9.505。该法检出限为10^-8g/L,用该法对金鱼肝脏组织中壬基酚进行检测,添加回收率水平在98.5%112.2%,变异系数在4.3%以下。

基因工程

903189 采用核酸外切酶Ⅲ纯化真核染色体外环状DNA[英]/Gaubatz,J.w.…∥Anal Biochem.-1990,184(2).-305～310[译自 DBA,1990,9(8),90-04215]采用核酸外切酶Ⅲ对线性及开环DNA 进行预备性消化.