微流控芯片环介导等温扩增技术检测3种猪圆环病毒

为建立快速区分3种猪圆环病毒(PCV2、PCV3和PCV4)的现场检测方法,采用微流控芯片环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),收集3种猪圆环病毒临床阳性样本进行核酸提取,与市场上3种猪圆环病毒荧光探针法检测试剂盒进行灵敏度、特异性和重复性同步比对。结果显示:微流控芯片LAMP法在3种猪圆环病毒联检测试中具有非常高的灵敏度,可以在30 min内,实现不低于荧光定量PCR法的敏感性;与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒临床阳性样本均无交叉反应,特异性好;测试3种猪圆环病毒重复性Ct值变异系数(CV)均在2%以下,稳定性好。结果表明:3种猪圆环病毒微流控芯片快速联检技术特异性好、灵敏度高、重复性强,检测速度快,环境要求低,可以满足现场检测的要求,适用于养猪场等场所的猪圆环病毒现场快速检测。本方法的建立为猪相关病原体的现场快速核酸检测提供了有力工具。

旋转式三温区微流控PCR扩增平台的研制

微流控芯片用于聚合酶链式反应(PCR)可提高检测效率和自动化程度,但目前把核酸提取、扩增、检测功能集成到一块芯片上仍比较困难,此外,微流控芯片专用PCR仪也存在温度控制不够快速、精准的问题。作者采用空间上温度循环代替时间上温度循环的设计思路,搭建了一套旋转式三温区微流控PCR扩增平台,对大肠杆菌进行核酸提取和扩增。结果表明,旋转式三温区微流控PCR扩增平台拥有较好的热均匀性和热稳定性,平台的升降温速率分别为3.5℃/s和2.67℃/s,单次循环时间为110 s。与9700型PCR仪相比,所建平台的温度控制方案更为简单、升降温速率更高、循环时间更短。本研究结果可为实现核酸提取、扩增一体化的微流控PCR设备的研发提供参考。

微流控芯片恒温扩增技术快速检测多种呼吸道病原体的应用

目的利用微流控芯片恒温扩增技术(LAMP-Disk)建立多种呼吸道病原体快速检测的方法,并对其临床应用的可行性和价值进行评估。方法设计和筛选针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒和肺炎支原体的LAMP引物对,利用盘式微流控芯片建立快速检测方法。以人工构建的参考品确定LAMP-Disk方法的检出限和分析特异性。收集268份呼吸道感染患儿的咽拭子样本,使用荧光定量PCR(qPCR)法与LAMP-Disk进行平行检测,从灵敏度、特异性及总体符合率等方面比较两种方法在临床应用的相关性和差异。结果LAMP-Disk检测方法对7种呼吸道病原体的检出限为3000~30000 copies/mL。在268份样本中,以qPCR方法为金标准,LAMP-Disk检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒和肺炎支原体的灵敏度分别为90.0%、86.5%、90.6%、64.8%、75.0%、88.2%和91.4%;特异性分别为99.6%、100%、99.2%、99.5%、99.2%、99.6%和100%;总体符合率为98.9%、98.1%、98.1%、92.5%、97.0%、98.9%和98.9%。结论采用LAMP-Disk方法同时检测多种呼吸道病原体,特异性和灵敏度好,操作简单快速,适合快速检测的应用场景。

液相流路控制与微流控核酸扩增芯片偶联系统的研制

随着载人航天和空间探测技术的进步,空间站特殊环境导致常规仪器无法直接在空间站内正常运行,使得改进和开发适用于空间站的生物分析检测设备变得非常重要。其中核酸作为一个重要的生物大分子,在生物科学研究中对它的分析是必不可少的。本研究针对核酸扩增设备在航天中的应用提出了一种液相流路偶联微流控核酸扩增芯片系统来解决微重力环境下核酸检测过程中对于液体处理的问题,实验结果表明液体混合良好,密封性良好,能满足微重力条件的液体传输。这一系统为基于微流控芯片的空间核酸分析设备的开发提供思路。

离心微流控芯片技术用于核酸等温扩增的研究进展

常规聚合酶链式反应对反应条件的要求很高,需要在多个温度下进行循环,而核酸等温扩增仅需在恒定温度下就能进行核酸的高效快速扩增。离心式微流控芯片技术具有微型化、集成化、高通量、自动化等优势,可实现实时、低成本生化检测分析。本文介绍了离心微流控芯片技术在核酸扩增前处理和核酸等温扩增中的应用,主要包括核酸提取、试剂预存储和核酸等温扩增等方面,并且对离心微流控芯片技术用于核酸等温扩增中存在的问题与未来的发展方向进行分析讨论。

流动型微流控PCR扩增芯片的研究

组装了由注射泵进样系统、微流控芯片和三温区加热器组成的流动型 PCR扩增系统 ,该系统具有扩增速度快、交叉污染小、芯片可重复使用和操作方便等特点 .优化了芯片厚度、隔热材料和流速等影响 PCR扩增的因素 .在 4 .9min内经 2 4个循环成功地扩增了浓度为 1 ng/1 0 0μL的λ-DNA( 5 0 0 bp) .

螺旋通道微流控PCR芯片连续自动扩增DNA片段的研究

研制了由内向外流动的螺旋通道微流控 PCR玻璃芯片 ,减少了 PCR反应液在微通道中流动时的分散和阻力 ;讨论了扩增循环数和进样速度对长片段基因扩增的影响 ,在 2 6min内成功扩增了质量浓度仅为1 0 ng/m L的 60 1 2 bpλ-DNA;通过将小孔径石英毛细管作为顺序注射 (SI)系统的连接管路 ,使其死体积降到 0 .3 0 μL.实现了微升级样品的自动换样、连续 PCR扩增和微通道洗涤等功能 .样品间无交叉污染 .每小时可扩增 5 0 0 bpλ-DNA试样 7个 .扩增产物片段大小和荧光强度的相对标准偏差分别为 0 .4%和 6.7% .

多重等位基因特异性扩增--微流控芯片电泳法同时测定多个单核苷酸多态性位点

文章以微流控芯片电泳为检测平台,建立了一种基于DNA适配器连接介导的多重等位基因特异性扩增同时测定多个单核苷酸多态性(SNP)位点的方法。以白细胞介素1β(IL1B)基因中的7个SNP位点(794C>T、1274C>T、2143T>C、2766T>del、3298G>A、5200G>A和5277C>T)为检测对象,通过PCR预扩增得一段含该7个待测SNP位点的长片段;用限制性内切酶MboⅠ将其消化成短片段,再与DNA适配器(adapter)相连;以连接产物为模板,在两管中分别用7条等位基因特异性引物和一条公用引物进行7重等位基因特异性扩增;最后用微流控芯片电泳法分离等位基因特异性扩增产物,根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。采用本法成功测定了48名健康中国人的IL1B基因上的7个SNP位点,与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)和测序法测定结果完全一致。本法结果准确,可用于同时测定多个SNP位点;以微流控芯片电泳作为检测平台,分析速度快,样品需要量少;借助于自制筛分凝胶和重复使用芯片,使得SNP分析成本大大降低。

呼吸道病原体核酸恒温扩增芯片十三联检在肺炎患者中的应用

目的:研究呼吸道病原体核酸环介导恒温扩增芯片法(LAMP)十三联检在肺炎患者中的应用,为临床诊断肺炎患者合理用药提供依据。方法:回顾性分析我院2019年1月至2019年11月期间,收治的肺炎患者269例,留取患者痰标本,分别进行细菌培养和LAMP十三联检,对比两种检测方法检出病原体种类、阳性率、一致性差异。结果:通过McNemar检验发现,流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌及嗜麦芽窄食单胞菌,LAMP十三联检检出率高于痰培养,差异有统计学意义(P<0.05);Kappa检验显示,两种检测方法在大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌的检出率具有一致性(κ>0.4),对于肺炎链球菌两种检测方法的一致性较高(κ>0.7),而其他病原体两种检测方法一致性较差(κ<0.4)。结论:LAMP十三联检比细菌培养的检出率更高,在肺炎链球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌中检出结果基本一致,且具有敏感性高、检测迅速、准确性好的优点,有助于肺炎患者的早期诊断和治疗,对临床治疗策略的选择具有指导意义,值得推广应用。

基于环介导等温扩增技术的微流控芯片在宠物疫病检测中的应用展望

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术与微流控芯片技术相结合,可实现对宠物疫病病原体的快速检测,具有高通量、特异性强、灵敏度高、操作简单、即时检测等优点。基于LAMP的微流控芯片应用于宠物疫病检测,可显著提高宠物疫病的病原学诊断能力和效率,成为宠物疫病的快速诊断及高效防控的重要手段之一。

环介导等温扩增微流控检测方法研究进展

环介导等温扩增技术是由日本荣研株式会社的Notomi等人提出的新型核酸扩增方法,在等温条件(60~65℃)下可高效、快速、特异性地扩增靶序列。微流控分析是微全分析系统的核心关键技术,将具有微小可控、功能集成的微流控芯片分析技术与环介导等温核酸扩增技术相结合,发展快速、灵敏、特异和适合即时检测的生物分子分析技术,可为我国食品安全、重大传染病防控、肿瘤及遗传性疾病等快速检测及诊断提供强有力的技术保障。

基于微流控平台的SARS-CoV-2核酸检测的研究进展

介绍了微流控技术的检测原理,综述了基于微流控平台的实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)、数字PCR、等温扩增、成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白等技术应用于的SARS-CoV-2核酸检测的研究现状,分析了基于微流控平台的SARS-CoV-2核酸检测的局限性,指出了基于微流控的SARS-CoV-2核酸检测系统在特异度、敏感度、检测限、重复性、信息化、质量控制及试剂成本等方面仍需要进一步的优化改进和临床验证。

基于核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术

病原微生物的快速检测对疫情的预防控制至关重要。基于PCR的病原微生物核酸检测方法克服了传统病原微生物培养方法耗时长、免疫学检测存在窗口期等问题,已成为目前最主要的病原微生物筛查方法。然而,对精确控温热循环仪的依赖却严重限制了其在资源匮乏地区的应用。虽然基于核酸等温扩增的病原微生物检测方法可摆脱对高精度温控设备的依赖,但仍需要进行样本核酸分离提取、扩增与检测等步骤。近年来,微流控技术与核酸等温扩增技术相结合,诞生了多种病原微生物等温扩增微流控检测技术。该技术通过设计芯片结构、优化进样模式及检测方式,实现了病原微生物核酸提取、扩增与检测一体化,并具备多重检测、定量检测等功能,具有对仪器依赖度小、对操作人员要求不高、样本量需求小和自动化程度高等优点,适合于在多种环境下的病原微生物快速检测。本文从核酸等温扩增原理、进样方式、检测方式等方面对核酸等温扩增病原微生物微流控检测技术进行了综述,以期为病原微生物的快速筛查提供更多的方案思路,提升公共卫生领域对传染性疾病的防控能力。

重组酶聚合酶扩增检测产志贺毒素大肠埃希菌的微流控芯片技术

采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),开发产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)的等温检测方法,结合圆盘式微流控芯片快速检测目标微生物。以stx1和stx2基因为靶点,设计和筛选适宜的RPA检测引物和探针序列,验证了19株STEC菌株(含9种stx基因亚型)和21株非STEC菌株,并采用人工污染的牛肉样品对集成化的微流控芯片进行评价。筛选出检测stx1和stx2基因的高特异性引物、探针组合,与美国农业部微生物实验室技术指南中STEC定量聚合酶链式反应(real-time polymerasechainreaction,real-timePCR)方法相比,目标基因检测的包容性和排他性均为100%。荧光RPA微流控芯片法在20 min内可同时进行32个反应,可检测STEC菌体灵敏度为9.5×10^(3)CFU/mL。根据GB 4789.6—2016《食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》的规定经增菌培养后在人工污染牛肉样品中可检测1 CFU/25 g的STEC污染,方法的相对正确度和相对检出水平均为100%。本研究开发了一种荧光RPA微流控芯片检测方法,可检测常见stx基因亚型STEC菌株,操作简单、反应速度快,适用于STEC的高通量快速检测。

微流控芯片恒温扩增技术快速检测米饭中的蜡样芽孢杆菌

为建立米饭中的蜡样芽孢杆菌微流控芯片恒温扩增快速检测方法,利用蜡样芽孢杆菌公开的hblA基因序列设计引物,加入荧光染料SYTO-9,采用微流控芯片通过环介导恒温扩增进行实时荧光读数,并通过24株菌株验证其特异性;分别用阳性质粒和阳性菌株测试其灵敏度、检出限和重复性。结果表明:2株蜡样芽孢杆菌呈阳性,22株非蜡样芽孢杆菌呈阴性;微流控芯片恒温扩增技术检测蜡样芽孢杆菌菌液的灵敏度为170 CFU/mL,检测时间在35 min内;使用合成的蜡样芽孢杆菌阳性质粒样品,其灵敏度为10μL-1,检测时间在15 min内,比传统分离鉴定方法的灵敏度高10倍;人工污染米饭中蜡样芽孢杆菌的检出限为570 CFU/g,并可在45 min内完成结果判定;蜡样芽孢杆菌阳性质粒检测重复性好,其变异系数(coefficient of variation, CV)为2.02%。综上所述,微流控芯片恒温扩增快速检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确,可用于米饭类食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测。

应用恒温扩增微流控芯片技术快速菌种筛查可疑关节结核

目的探讨恒温扩增微流控芯片(isothermal amplification microfluidic chip,IAMC)技术快速筛查关节结核感染的应用价值。方法应用恒温扩增(isothermal amplification,IA)法和罗氏培养法对19例疑似关节结核感染患者标本行菌群鉴定,应用共焦滤波技术、荧光染料技术将标本的核酸通过恒温扩增法使结果量化,同时将标本核酸结果比对阴性对照、阳性对照的核酸结果以此鉴定结果准确性。结果恒温扩增法检测出13例阳性样品,阳性率为68.42%(13/19);罗氏培养法检测出7例阳性样品,阳性率为36.84%(7/19);对比差异有统计学意义(χ2=5.115,P<0.05)。Kappa值为0.424,一致性好。结论恒温扩增微流控芯片荧光检测核酸技术可快速、准确、简便地检测可疑关节结核中结核分枝杆菌复合群,可作为筛查诊断。

基于环介导等温扩增的离心式微流控芯片检测3种致病菌

采用微流控技术可以将食源性致病菌样品的制备、分离、检测等基本单元集成到仅有几平方厘米的芯片上,与分子检测技术相结合,能够满足对食源性致病菌快速现场检测的需要。基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),设计制作出一种用于食源性致病菌快速检测的离心式微流控芯片。通过离心式微流控核酸等温扩增装置实现微流控芯片上的流体控制、等温扩增及可视化检测,可1次进行5种样品的3种食源性致病菌的检测。结果显示,基于LAMP的离心式微流控方法用于检测大肠杆菌、沙门氏菌和单增李斯特氏菌,能够在60 min内完成芯片的可视化检测,并且检测结果具有良好的特异性及敏感性,检测限为10^(3)copies/μL。将微流控技术用于食源性致病菌的核酸提取、等温扩增及检测,具有集成化、易于携带和快速分析等优势,在食品安全快速检测中具有应用的潜力。

微流控芯片环介导恒温扩增技术快速检测8种肠道致病菌

目的结合微流控芯片环介导恒温扩增技术(LAMP),建立可同时检测粪便中8种肠道致病菌的微流控芯片LAMP检测方法,为感染性腹泻的临床诊断提供依据。方法根据8种肠道致病菌(志贺菌、沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、肠聚集性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌)的特异目的基因分别设计微流控芯片LAMP引物,加入EvaGreen荧光染料,采用微流控芯片LAMP对8种肠道致病菌同时进行实时荧光监测;提取8种肠道致病菌的基因组DNA,对建立微流控芯片LAMP的特异度和灵敏度进行评价;制备模拟粪便样本对该技术的最低检出限进行评价。结果微流控芯片LAMP可实现8种肠道致病菌的特异性检测,对福氏志贺菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、肠聚集性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌和肠产毒素大肠埃希菌的检测灵敏度可达100 CFU/mL;对模拟粪便样本中福氏志贺菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、肠道侵袭性大肠埃希菌、肠道致病性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌的最低检出限均为100 CFU/mL;对空肠弯曲菌和肠聚集性大肠埃希菌的最低检出限为1000 CFU/mL。结论该实验建立的微流控芯片LAMP特异性好、灵敏度高、结果准确,可用于粪便中8种肠道致病菌的同步快速检测。

基于核酸检测的微流控芯片设计与传热分析

为了解决传统数字聚合酶链式反应(PCR)扩增过程中移液操作产生的问题以及升降温速率慢的弊端,设计了一种连续流数字PCR微流控芯片,能对包含PCR反应体系的微滴进行快速扩增,可以提升核酸检测过程中的扩增效率。用COMSOL对芯片微通道内部的温度分布和两相流体的共轭传热进行了数值模拟。结果表明,芯片内部能产生95、55和72℃的均匀温区,各个温区的温度变化均在±2℃以内,可以满足PCR的温度要求。微通道内中心区域流体流速最高,且由0.1~20 mm/s变化时,微滴在目标温区的停留时间减少,扩增效率降低。根据仿真结果进行了流速为5、10、15和20 mm/s的实验,仅流速为5 mm/s时符合扩增要求,微流控芯片的扩增效率为PCR扩增仪的98%,扩增时间缩短为扩增仪的18.9%。为进一步开发集微滴生成、扩增和检测于一体的数字PCR设备提供了一种可行的技术手段。

遗传学实验教学的前沿拓展——等温扩增技术和微流控芯片技术的引入与思考

现代遗传学学科与技术的飞速发展对本科生遗传学实验教学提出了更高的要求。探索如何将新知识、新技术、新案例引入传统的实验教学课程正成为当前教学改革的重要方向。等温扩增技术是经典的聚合酶链式反应技术的拓展和延伸,具有极强的应用性,基于等温扩增的微流控芯片核酸检测技术现已广泛应用于转基因鉴定、病原体鉴定等核酸检测工作中。将基于环介导等温扩增的微流控芯片核酸检测技术快速鉴定转基因材料实验作为遗传学实验教学新案例,能够在拓展学生前沿视野的同时,大大激发学生探索科学的兴趣,培养学生的创新精神和解决实际问题的能力。该实验实施以来,深受学生欢迎,取得了较理想的教学效果,有利于后期进一步实践与推广。