“一锅法”等温核酸扩增策略联合荧光定量侧流层析技术对多种细菌16S rRNA的超灵敏检测

致病菌对人类健康构成了极大的威胁,因此及时、灵敏地检测病原体是确诊感染源、预防疾病传播和改善患者治疗的关键。最近的研究表明,细菌的16S rRNA包含了种间差异信息,而典型的细菌则拥有约10000个16S rRNA拷贝。因此,使用16S rRNA作为检测模板对于低浓度病原体的即时检测(POCT)具有重大意义。

基于锁核酸及等位位点特异性扩增技术的KRAS基因突变检测荧光定量PCR方法研究

基于等位位点特异性扩增的原理,设计锁核酸修饰KRAS基因突变特异性扩增引物,结合封阻探针技术,建立检测KRAS基因突变的荧光定量PCR方法。结果发现,锁核酸修饰的引物及探针可显著提高等位位点特异性扩增技术用于复杂样本中的微量基因突变检测的敏感度,该技术检测KRAS基因突变的敏感性可达0.01%~0.1%。进一步用建立的荧光定量PCR方法检测52例结直肠癌患者血浆标本,并用DNA测序法作为对照,同时用健康人血浆标本建立阴性检测结果判读标准,以初步评价该方法应用于循环DNA中KRAS基因突变检测的可行性。结果发现结直肠癌患者KRAS基因突变主要是G12C、G12A和G12R,而且q PCR法的阳性检出率为46.15%,高于DNA测序法(13.46%),阴性结果与DNA测序法的符合率为100%。此外,结直肠癌患者外周血KRAS基因的突变检出率与文献报道组织标本中的突变检出率及常见突变类型基本相符。上述结果说明该方法检测循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)具有较高的可靠性,可以用于肿瘤患者循环血液中KRAS基因突变的检测。

实时荧光核酸恒温扩增技术检测尿液中淋球菌的分析

目的评价实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)检测淋球菌(NG)的特异性和敏感性。方法对218例疑似患者生殖道拭子行SAT,PCR和NG培养检测,同时对对应的218份尿液标本行SAT检测。结果 SAT平行检测同一来源的拭子标本和尿液标本,检测结果完全一致。与NG培养法相比,SAT对尿液/拭子标本的检测灵敏度为100.00%,特异性为99.27%;与PCR法相比,SAT对尿液/拭子标本的检测灵敏度为100.00%,特异性为97.08%。SAT法对拭子标本和尿液标本检测结果的符合率为100.00%,经卡方检验,差异无显著性(χ2=0,P>0.05)。结论 SAT技术检测拭子及尿液中的NG具有很高的灵敏度和特异性,与NG培养相比耗时短,与PCR相比其可用于判愈,防止过度治疗。为NG的实验室诊断提供新的检测方法。

STR基因座荧光标记复合扩增检测及其法医学应用

目的建立荧光标记复合扩增检测4个STR基因座的方法,应用于法医学亲权鉴定与个人识别。方法用6-FAM标记D3S1754引物,HEX标记D4S2366和D12S375引物,TMR标记D1S549引物,PCR复合扩增,310基因分析仪电泳自动收集电泳结果数据,GeneScanAnalysisSoftware3.7NT计算扩增产物片段相对大小,Genotyper誖3.7NT软件进行样本基因型分型。将该方法应用于法医学亲权鉴定与个人识别。结果建立了荧光标记复合扩增检测4个STR基因座基因型的方法,具有良好的稳定性和较好的灵敏度,分型结果准确。结论研究建立的方法操作简便,分型结果稳定可靠,可用于遗传多态性研究和法医学亲权鉴定与个人识别。

荧光定量基因扩增法与萋-尼抗酸染色法检测结核分枝杆菌的比较

目的对荧光定量基因扩增法(FQ-PCR法)和萋-尼抗酸染色法检测结核分枝杆菌的准确性和阳性率进行比较。方法 88例肺结核患者的痰标本,分别用FQ-PCR法和萋-尼抗酸染色法进行检测。对比两种方法的检测结果。结果 FQ-PCR法有55例阳性,检出率为62.5%,萋-尼抗酸染色法检测有20例阳性,检出率为22.7%,明显低于FQ-PCR法。结论在检测结核分枝杆菌的方法中,FQ-PCR法的检出率明显高于萋-尼抗酸染色法的检出率,所以在临床诊疗工作当中,临床医生应该更多选择FQ-PCR法检测结核分枝杆菌,以便在肺结核的早期诊断和早期治疗中发挥更大的作用。

恒温扩增核酸仪校准方法

介绍了恒温扩增核酸分析仪的工作原理。根据仪器的性能提出了该仪器的校准项目和技术指标:温度示值误差、温度均匀度、温度波动度、样本检测重复性、荧光强度或浊度检测重复性和荧光强度或浊度线性;重点探讨了仪器计量指标的校准方法,形成了一套系统的恒温扩增核酸分析仪校准方法,并对恒温扩增核酸分析仪进行了实际校准。结果表明,该方法科学合理、简便易行,可操作性强,可用于评价仪器计量性能,为仪器日常的校准工作以及国家计量校准规范的制定奠定了基础。

孕妇外周血中胎儿细胞基因扩增及核酸序列分析鉴定

目前对性连锁遗传病采取遗传咨询、产前胎儿性别鉴定、选择性流产为主要预防方法，传统的细胞遗传学方法存在费时、费力的缺点。本研究利用半巢式ＰＣＲ技术扩增Ｙ染色体上锌指结构基因（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ－Ｙｇｅｎｅ，ＺＦＹ）［１］，并进行核酸测序判定胎儿性别...

荧光偏振与非对称基因扩增技术联用分析全血XPD基因单核苷酸多态性

荧光偏振检测技术是一种新型的基因诊断技术，不需要分离结合和未结合的探针，不依赖荧光强度，具有反应速度快、效率高、准确及成本低等优点，尤其在检测小分子领域具有很强的优势。单核苷酸多态性SNP（Single nuclear polymorphism）作为公认的第三代遗传标记与肿瘤易感性与治疗反应性关系明确，几乎所有肿瘤都可以通过对第三代遗传标记的检测，在基因水平预警和进行早期干预治疗。

定量分析的体外基因扩增法

定量分析的体外基因扩增法解放军农牧大学刘纯杰综述军事医学科学院生物工程研究所张兆山审校ＰＣＲ技术自１９８５年建立以来，在短短的几年里得到了迅速的发展和广泛的应用，被誉为分子生物发展史上的一个重要里程碑。笔者曾就ＰＣＲ技术的新发展及ＰＣＲ在基因重组与突...

恒温荧光扩增法快速检测食品中金黄色葡萄球菌

目的建立恒温荧光扩增法快速检测食品中的金黄色葡萄球菌.方法基于重组酶介导链替换核酸扩增技术针对金黄色葡萄球菌nuc基因的保守区域设计特异性引物和探针,建立了检测金黄色葡萄球菌的恒温荧光扩增检测方法,并评价其敏感性、特异性、重复性和符合率.结果该方法可在常温(37~42℃)实现核酸快速扩增,20 min即可完成反应;敏感性较高,金黄色葡萄球菌的检出限为9.12×10^(2) CFU/mL;特异性强,与大肠埃希氏菌O157∶H7、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌的核酸均无交叉反应;不同稀释度菌液检测阈值时间的变异系数为5.78%~5.93%,重复性较好;采用该方法与荧光聚合酶链反应方法同时对50份临床样品进行检测,总符合率均为100%,差异不显著(P>0.05).结论本研究建立的金黄色葡萄球菌恒温荧光扩增检测方法具有敏感性高、特异性强、时间短的特点,可用于金黄色葡萄球菌的快速检测.

X染色体Amelogenin基因座片段扩增峰图异常1例及荧光定量分析

AMEL基因座（amelogeni,AMEL牙釉基因座）是法医学在进行亲子鉴定和个体识别中性别确认时常用的基因座,是X、Y染色体上的同源染色体基因,位于X染色体的Xp22.1-Xp22.3和Y染色体的Yp11.2,编码牙釉质蛋白[1]。不同试剂盒扩增,这一基因的产物长度有所不同[2]。

猪蓝耳病在荧光PCR检测中的常见问题与分析

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)又称猪蓝耳病,其荧光PCR(Q-PCR)检测是目前很多实验室常用的诊断方法。但在实际操作中,经常会遇到扩增曲线出现“翘尾”现象、有扩增曲线但无Ct值以及不知道如何选择全血、血清和血浆等问题,现分析如下。1荧光PCR的反应过程1.1荧光PCR反应过程的3个阶段Q-PCR是在PCR反应体系中添加荧光报告基团和荧光淬灭基团,通过荧光信号来实现对核酸分子的定量检测过程,并通过制作的标准曲线对添加的原始模板进行相对定量的分析。

实时荧光核酸恒温扩增技术和液体培养法在不孕不育人群解脲脲原体检测中的应用比较

目的比较实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和液体培养法在解脲脲原体(UU)检测中的诊断价值,以选择更为准确、快速、实用的临床检测方法。方法采集本院就诊的不孕不育对象200例的分泌物2份拭子样本,分别用于液体培养法和SAT法检测。结果液体培养法阳性率为60%,SAT法阳性率为47%,培养法阳性率高于SAT法,女性UU阳性率显著高于男性,26例结果不一致中有11例培养阴性SAT阳性,15例培养阳性而SAT阴性,SAT法的敏感性(100%)和特异性(93.5%)均高于培养法。结论解脲脲原体在不孕不育人群中感染率较高,加强就诊对象UU的筛查、诊治和预防,确保优生优育。SAT技术简便、快速、精准,具有较高的临床实用性,是适合实验室诊断的检测方法 。

比较实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和液体培养法在解脲脲原体(UU)检测中的诊断价值

目的:研究在解脲脲原体(UU)检测中实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和液体培养法的诊断价值。方法:收集141例2018年6月~2019年6月间前来某院就诊的疑似解脲脲原体感染的患者为研究对象,所有患者均采集2份拭子样本,其中1份拭子样本进行SAT检测,1分拭子样本进行液体培养,比较两种检测结果。结果:SAT法检测阳性率低于液体培养法(P<0.05);SAT法检测灵敏度高于液体培养法(P<0.05),特异度高于液体培养法(P<0.05)。结论:解脲脲原体(UU)检测中SAT法比液体培养法灵敏度和特异度高,而且低污染、时间短、样本采集方便、反应稳定,检测结果更加准确。

新型恒温核酸扩增法快速检测副溶血性弧菌的研究

利用DNA环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)设计一对外引物和一对内引物,通过引物特异性识别tlh基因上的六个独立区域来快速检测副溶血弧菌。同时将检测结果与PCR方法进行比较。结果表明,LAMP反应在65℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;肉眼观察阳性结果出现白色混浊现象,添加1×SYBRGreenI荧光染料后,绿色的阳性结果很明显区别于橙色阴性结果;LAMP方法的最低检出限为10CFU/ml,PCR方法为103CFU/ml,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法的100倍。因此,LAMP方法用于快速检测副溶血弧菌具有检测过程简单、反应结果肉眼即辨别并且灵敏度高特异性强的特点。实验装置简便,能够提供稳定热源即可,所以LAMP方法特别适合于现场快速诊断。

禽腺病毒血清4型实时荧光RAA检测方法的建立

为了快速准确地诊断禽心包积液-肝炎综合征(hydropericardium-hepatitis syndrome,HHS),试验根据禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)的六邻体(Hexon)基因保守序列设计特异性引物和探针,将重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)与荧光探针结合,通过对反应条件(温度和时间)进化优化建立一种用于检测FAdV-4的实时荧光RAA方法,对该方法进行特异性、敏感性、重复性试验,并分别采用该方法、普通PCR方法和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RFQ-PCR)方法检测56份鸡肝脏样本,并计算该方法与其他两种方法的符合率。结果表明:建立的实时荧光RAA方法在40℃条件下反应15 min即可完成检测;仅可检测出FAdV-4,与禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)和传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)均无交叉反应,特异性较强;对FAdV-4的最低检测限为1×10~1拷贝/μL,是普通PCR方法的100倍,与RFQ-PCR方法相当,敏感性较高;重复性试验中的组内重复性试验和组间重复性试验的变异系数(coefficient of variation,CV)均小于10%,重复性良好;对56份临床样品进行检测,该方法与RFQ-PCR方法和普通PCR方法的符合率分别为100%、96.43%。说明成功建立了FAdV-4的实时荧光RAA检测方法,该方法操作简便、快速,特异性较强,敏感性较高,重复性良好,可用于HHS的早期诊断。

微量淋巴细胞毒技术与核酸扩增荧光技术检测HLA-B27的对比

目的通过比较核酸扩增荧光技术(PCR-染料法)和微量淋巴细胞毒技术在检测HLA-B27中的符合率,分析两种方法的优势与不足,探讨核酸扩增荧光技术(PCR-染料法)在HLA-B27检测中的临床应用价值。方法随机选取197例来我科就诊的疑似强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者的样本,分别使用微量淋巴细胞毒法和PCR-染料法检测。并对两种方法检测结果不符的样本进行测序复核。结果 197例样本中,微量淋巴细胞毒法检出HLA-B27阳性150例,阴性47例;PCR-染料法检出阳性135例,阴性62例;两种方法检测结果有统计学差异(P<0.01)。15例差异样本,两种方法与测序法相比较的符合率,微量淋巴细胞毒法为13.3%,PCR-染料法为86.7%。结论核酸扩增荧光技术(PCR-染料法)和微量淋巴细胞毒法比较,前者具有更高的临床准确性。在样本处理上PCR-染料法也更具优势,操作简单方便,有很强的临床应用价值。

优化的套式核酸体外扩增方法用于甲型流感病毒快速诊断的研究

目的临床上对流感的有效控制与治疗在于实验室快速与准确的诊断,这对于指导用药和避免滥用抗生素具有重要意义。RT_PCR在流感病毒检测中特异性和灵敏度较强,nestedmultiplexRT_PCR法可以在此基础上提高灵敏度。实验的目的是应用分子生物学方法对流感病毒进行快速诊断。方法我们结合流感病毒M基因、NS基因、HA基因的结构和进化特性设计多元引物达到流感病毒的型和亚型准确与快速的鉴定。结果甲型流感病毒以M基因保守区域设计引物,PCR后电泳带为413bp;甲型流感病毒以HA基因分亚型,H1N1亚型PCR后电泳带为348bp,H3N2亚型PCR后电泳带为291bp,H5N1亚型PCR后电泳带为326bp。结论应用优化的套式核酸体外扩增方法进行流感病毒的型与亚型的诊断是比较快速的,且所需要的病毒量少(0.01～0.1TCID50),灵敏度较高。

西安地区256例Gene Xpert MTB/RIF阳性肺结核患者rpoB基因突变特征分析

目的分析西安地区256例利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Gene Xpert MTB/RIF)阳性肺结核患者rpoB基因突变特征。方法本研究为回顾性分析。256株结核分枝杆菌(MTB)菌株分离自2020年6月至2022年6月于陕西省结核病防治院就诊的Gene Xpert MTB/RIF阳性肺结核门诊及住院患者,菌株无重复收集,来自痰液标本174份、支气管肺泡灌洗液标本82份,患者年龄(45.67±8.36)岁。采用DNA直接测序法对256株利福平耐药MTB菌株rpoB基因的PCR产物进行分析。将256株利福平耐药MTB菌株根据利福平耐药程度分为低、中、高耐药MTB菌株,采用χ^(2)检验比较3种菌株突变位点。人工诱导3株利福平耐药MTB菌株,采用DNA直接测序法对其rpoB基因的PCR产物进行分析。结果测序报告显示,256株利福平耐药MTB菌株中有253株发生rpoB基因位点突变,突变率为98.83%(253/256)。突变类型包括C→T、T→G、C→G、A→T、C→A、A→G、G→A、G→T、T→C、A→C共计10种,涉及丝氨酸、亮氨酸、丙氨酸、组氨酸、酪氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甘氨酸共14个氨基酸密码子,均为点突变。利福平耐药菌株突变主要集中在531位[53.75%(136/253)]、526位[23.32%(59/253)],其他位点包括513、516、533、515、513、532、522、511、519、518、533。高耐药MTB菌株531位氨基酸突变发生率与低、中耐药MTB菌株比较[66.91%(91/136)比37.88%(25/66)、37.04%(20/54)],差异有统计学意义(χ^(2)=22.154,P<0.001);低、中耐药MTB菌株531位氨基酸突变发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。低、中、高耐药MTB菌株526位氨基酸突变发生率比较[22.73%(15/66)、25.93%(14/54)、22.06%(30/136)],差异无统计学意义(χ^(2)=0.331,P=0.847)。人工诱导的3株利福平耐药MTB菌株均发生rpoB基因位点突变,低、中耐药MTB菌株突变均位于526位点,高耐药MTB菌株突变位于531位点。结论西安地区Gene Xpert MTB/RIF阳性肺结核患者rpoB基因突变率较高,以点突变为主,主要集中在531位、526位,531位TCG→TTG突变在rpoB基因突变类型中突变频率最高,且与高耐药有关。

STR遗传标记荧光复合扩增系统的法医学应用

目的:建立D20S601、D6S474、D6S2418荧光标记复合扩增体系,并对其进行法医学实用性研究。方法:利用传统复合扩增技术扩增D20S601、D6S474、D6S2418基因座,在不同条件下对复合扩增系统的同一性、灵敏性、可重复性等进行测试,用实际案例进行验证。结果:建立的D20S601、D6S474、D6S2418荧光标记复合扩增体系的扩增条件要求不高,法医实用性研究证明该体系实用性好。结论:建立了D20S601、D6S474、D6S2418遗传标记的荧光标记复合扩增体系。法医学应用性研究证明,该系统分型结果稳定,重复性好,灵敏度高,对陈旧斑痕具有检测能力,能够对常见介质上的斑痕正确分型,与常见的动物及微生物无交叉反应,可成功应用于法医检案。