核酸荧光探针检测在临床疾病分子诊断中的应用

核酸荧光探针检测正逐渐成为临床疾病分子诊断的重要手段。这项技术主要应用具有高度特异性的荧光探针靶向疾病相关核酸序列,从而实现对目标核酸的高灵敏度、高特异性检测。核酸荧光探针检测在临床中的应用十分广泛,包括感染性疾病、遗传性疾病和肿瘤的诊断。而随着纳米技术的不断发展,具有更高检验效能的核酸荧光探针检测体系也不断产生。其中基于荧光淬灭纳米材料构建的均相核酸检测体系由于其较高的检测能力和简单的体系,将有助于进一步推动疾病分子诊断的发展。该文主要述评了核酸荧光探针检测在多种疾病诊断中的临床应用,并讨论了利用荧光淬灭纳米材料构建的均相核酸检测新体系的原理和应用价值。

盐酸黄连素作为脱氧核糖核酸荧光染料染色效果的研究

考察了盐酸黄连素(berberine hydrochloride)的荧光强度与双链DNA的相关性;优选盐酸黄连素在琼脂糖凝胶电泳中的最佳条件;将其染色效果与溴化乙锭(EB)进行比较;并从相对迁移率角度研究盐酸黄连素对DNA凝胶电泳的影响。结果显示,双链DNA对盐酸黄连素有明显的荧光增强作用,荧光强度与dsDNA的浓度正相关;凝胶中10 mg/L的盐酸黄连素可分辨出10 ng的100 bp DNA条带,在完全相同的操作条件下,对于小片段dsDNA,其灵敏度略低于EB。因盐酸黄连素在碱性溶液中带正电荷,使DNA相对迁移率减小,但较染料EB的影响小。该研究为盐酸黄连素在日常分子生物学研究中的应用提供了理论依据。盐酸黄连素可以作为琼脂糖凝胶电泳中DNA的荧光染料,其荧光强度能够满足常规应用,可以替代强致癌性染料EB。

两种新型镍-邻菲咯啉类核酸荧光探针的合成及性质研究

合成了咪唑并[f]邻菲咯啉(IP)和对羟基苯基咪唑并[f]邻菲咯啉(PHPIP)两种配体,并合成了两种新配合物Ni(Phen)2PHPIP和Ni(Phen)2IP,对其进行了表征,用紫外光谱、静态荧光光谱研究了配合物与小牛胸腺DNA的结合情况。两种配合物均与DNA有强烈作用,其中配合物Ni(Phen)2PHPIP在水溶液中几乎无荧光,而加入DNA后,能发射出很强的荧光,可以作为检测核酸分子的荧光探针。

核酸荧光探针TOTO单体噻唑橙的合成研究

研究设计了以 2 巯基苯并噻唑和 4 甲基喹啉为主要原料 ,合成核酸荧光探针TOTO单体噻唑橙 (TO)的工艺路线。采用碘甲烷和对甲苯磺酸甲酯 ,先后对 2 巯基苯并噻唑进行了氮甲基化和巯甲基化反应 ,收率分别为 92 4 %和 91%。其后 ,用 4 甲基喹啉与 1,3 二溴丙烷反应 ,并将其产物与两步甲基化后产物反应 ,合成了目的产物TO ,后两步收率分别为 5 2 5 %和6 1 2 %。经核磁共振谱鉴定产品结构正确 。

核酸荧光探针新进展

核酸荧光探针新进展田少敏阮康成（中国科学院上海生物化学研究所，上海２０００３１）关键词核酸荧光探针核酸荧光探针作为核酸标记的工具，具有方便、快速、灵敏和安全等特点，近年来得到很大发展，不但种类明显增加，性质上也有进一步改善。下面就笔者得到的最新资料，...

核酸荧光染料在单细胞凝胶电泳中的染色比较

目的探讨4种核酸染料(EB、SYBR GreenⅠ、Gold View和AO)在单细胞凝胶电泳(SCGE)中的染色特性,以分析用新型核酸荧光染料代替EB染料的可能性。方法分离提取健康人外周血淋巴细胞,分别用0、20、40、60、80μg/m L的H2O2进行处理,中性SCGE检测淋巴细胞DNA损伤情况;分别用EB、SYBR GreenⅠ、Gold View和AO进行染色,荧光显微镜下观察并比较染色结果。分析尾部DNA百分含量(%Tail DNA)以比较组间差异。结果 SCGE结果表明,SYBR GreenⅠ、Gold View和AO均能很好的反应实验结果,不同浓度中,1×~5×SYBR GreenⅠ、2×~5×Gold View、2~5μg/m L AO为最佳染色浓度范围。EB、SYBR GreenⅠ、Gold View和AO的回归系数分别为2.71、2.81、2.73、2.75,其染色效果较为一致,稳定性分析结果表明,3组细胞在48 h以内结果稳定,%Tail DNA差异无统计学意义(P均>0.05);SYBR GreenⅠ、Gold View和AO实验室内精密度分别为6.92%、7.10%、8.25%,优于EB染色(8.35%);SYBR GreenⅠ和Gold View重复性分别为3.07%、2.74%,优于EB染色(3.59%)。结论SYBR GreenⅠ、Gold View和AO均可用于本实验染色,Gold View是更适合用于SCGE中替代EB的核酸荧光染料。

核酸荧光探针在单细胞成像中的应用研究

单细胞成像研究技术具有观测定位精准、独特的时间和空间分辨率高等特点,成为分子水平上准确、实时、原位监测细胞内生物活性物质信号变化及观测细胞形态的重要手段。在进行单细胞成像研究时,细胞内大多数生物活性物质自身无法产生易被仪器或肉眼所捕获的信号,通常需要使用生物探针进入细胞内特异性识别生物活性物质。生物探针与特定的生物活性物质结合,形成稳定的复合物,产生相应信号变化。通过监测生物探针信号变化,实现对细胞内生物活性物质准确、实时、原位监测。生物探针的响应信号有多种,其中荧光信号不仅具有直观、操作简单、选择性好、灵敏度高、无需参比、不受电磁场的影响、可远程实时在线自动监测等特性,还具备对细胞进行静态观察、对细胞内分子动力学进行动态监测、对亚细胞结构进行定位和对蛋白质分子的相互作用进行研究等优点,在细胞成像技术研究中具有重要地位。本文综述了近五年来核酸荧光探针在单细胞成像中的应用研究进展,讨论了存在的问题,对发展方向进行了展望。

核酸荧光定量PCR检测“疣毒净”洗剂对体外人乳头瘤病毒清除作用的实验研究

目的:观察中药“疣毒净”洗液在体外对HPV的影响,以阐明其治疗机理。方法:从临床切除的CA标本中提取HPV,加入中药“疣毒净”后,提取HPV-DNA,用FQ-PCR法测定其病毒含量。结果:含HPV的试管加入“疣毒净”后,经3次反复测试,24h即不能测出HPV,而对照管及非相关中药管均含同等浓度的HPV-DNA拷贝。结论:“疣毒净”具有明确的杀灭HPV的作用,这可能是它治疗CA的机制。

结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测对菌阴空洞肺结核的诊断效能分析

目的探讨结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert)检测对菌阴空洞肺结核的诊断效能。方法选取河北省胸科医院2021年4月至2022年10月期间行手术治疗的124例肺部空洞疾病患者相关病历资料,其中菌阴空洞肺结核86例(观察组),非结核肺部空洞疾病38例(对照组)。收集患者手术标本Xpert检测和外周血结核感染T细胞斑点(T-SPOT)试验结果,分析二者对菌阴空洞肺结核的诊断效能。结果Xpert检测和T-SPOT试验诊断菌阴空洞肺结核的敏感度为68.6%、75.6%,特异度为97.4%、68.4%。Xpert检测的敏感度低于T-SPOT试验(χ^(2)=5.832,P<0.001),特异度高于T-SPOT试验(χ^(2)=21.469,P<0.001)。2种方法在观察组中的阳性检出率均高于对照组[Xpert检测:68.6%(59/86)比2.6%(1/38);T-SPOT试验:75.6%(65/86)比31.6%(12/38)](均P<0.001)。受试者工作特征曲线分析结果显示,Xpert检测诊断菌阴空洞肺结核的曲线下面积为0.830,T-SPOT试验的曲线下面积为0.729,Xpert检测的准确度高于T-SPOT试验(P<0.001)。结论Xpert检测对菌阴空洞肺结核有比较可靠的诊断效能。

RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术在儿童支原体肺炎早期诊断及疗效判断中的价值

目的 考察实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)在儿童肺炎支原体肺炎(MPP)早期临床诊断中的价值及其在评价MPP转归以及判断药物疗效中的作用。方法 选取社区获得性肺炎(CAP)住院患儿451例,所有患儿在入院24 h内采集血清标本,采用被动凝集试验检测肺炎支原体(MP)特异性抗体[MP抗体检测(MP-Ab)],并采集咽拭子标本提取MP-RNA(MP-SAT法)。对MPP患儿在完成大环内酯类药物治疗第1疗程、完成大环内酯类药物治疗第3疗程时复查MP-Ab和MP-RNA。根据MPP诊断标准将其分为MPP组(n=183)和非MPP组(n=268)。比较MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性(敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值)。对病程<7 d入院前未使用大环内酯类药物的MPP患儿进行动态观察,考察在大环内酯类药物(阿奇霉素)治疗MP不同时间点(入院时、完成第1疗程和完成第3疗程时)MP-SAT和MP-Ab的阳性率以及患儿临床和影像学表现(咳嗽、发热、肺部体征和CT表现)变化情况。结果 MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性比较差异无统计学意义(P>0.05);病程<7 d患儿组中MP-SAT诊断MPP的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均优于MP-Ab(P<0.001或P<0.05或P<0.01)。病程<7 d入院前未使用大环内酯类药物治疗的MPP患儿共42例,该组患儿在入院时、完成阿奇霉素治疗第1疗程和完成阿奇霉素治疗第3疗程时,MP-SAT检测阳性率分别为88.09%(37/42)、88.09%(37/42)和9.52%(4/42);MP-Ab检测阳性率分别为26.19%(11/42)、100.00%(42/42)和100.00%(42/42),在不同时间点MP-SAT和MP-Ab阳性率比较差异有统计学意义(P<0.001,P<0.05,P<0.001)。该组患儿完成第3疗程时MP-SAT阳性率较入院时明显下降(P<0.001),临床症状(咳嗽、发热)、肺部体征及肺部CT表现较入院时明显好转(均P<0.001),MP-SAT结果与临床症状、肺部体征及肺部影像学表现变化趋势相一致。结论 SAT检测MP-RNA可作为儿童MPP的早期诊断依据,同时也可作为评价MPP转归及判断临床治疗效果的指标。

猪伪狂犬病毒荧光重组酶介导核酸扩增快速检测方法的建立与应用

【目的】基于荧光重组酶介导核酸扩增(Recombinase-aided amplification,RAA)技术,建立一种猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)快速检测方法。【方法】根据PRV gE基因序列,设计特异性引物及探针,优化扩增体系,建立PRV荧光重组酶介导核酸扩增检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,应用该方法对临床样品进行检测。【结果】该方法在43℃恒温反应23 min即可完成PRV核酸扩增,最低检出限为111 copies·μL^(-1);与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrheavirus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcinerotavirus,PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)均无交叉反应。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于5%;40份临床样品检测结果显示PRV阳性率为15%(6/40),检测结果与常规聚合酶链式反应(PCR)一致。【结论】成功建立了简便快速、高效准确的PRV实时荧光RAA检测方法,为PRV的快速检测和流行病学调查提供了新的检测手段。

荧光定量核酸扩增检测技术与环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的对比研究

目的对比荧光定量核酸扩增检测技术与环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的应用价值。方法随机在2020年1月~2023年1月天津市河东区疾病预防控制中心接收的呼吸道感染的患者中选取120例作为研究对象,分别采用荧光定量核酸扩增(PCR)检测技术与环介导等温扩增技术(LAMP)检测呼吸道病原体,并对检测结果进行比较分析。结果120例患者中使用LAMP检出细菌感染85例(阳性率为70.83%)。荧光定量PCR检出细菌感染72例(阳性率60.00%),差异无统计学意义(P>0.05);其中LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于荧光定量PCR法,差异有统计学意义(P<0.05);采用荧光定量PCR与LAMP法对呼吸道感染10种病原体进行检测,结果表明,除LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、流感嗜血杆菌的检测一致性极好,荧光定量PCR对耐甲氧西林葡萄球菌的检测一致性极好(Kappa≥0.75),其余病原体采用荧光定量PCR与LAMP法检测一致性均中等(0.4≤Kappa<0.75)。结论荧光定量PCR与LAMP两种检测方法对呼吸道感染病原体检出率均较高,其中LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于荧光定量PCR法。

奶牛乳房炎病原微生物20联核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的临床应用评估

为了评估商品化的奶牛乳房炎病原微生物20联核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(后文简称为“检测试剂盒”)在临床应用中的适用性,本试验采用传统细菌分离培养、检测试剂盒、16S rRNA基因扩增子测序和药物敏感性试验对宁夏回族自治区9个牧场155份奶牛乳房炎奶样分别进行菌株鉴定和耐药性检测,并将检测试剂盒与其他3种检测结果进行比较和分析。结果显示,检测试剂盒与传统细菌分离培养在病原菌检出情况上基本保持一致,均主要检出了大肠杆菌、芽孢杆菌属和凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)等;检测试剂盒与16S rRNA基因扩增子测序结果在菌属组成上一致性较高,均主要检出了假单胞菌属、链球菌属和葡萄球菌属等;药物敏感性试验结果显示,检出率较高的66株病原菌分离株对β-内酰胺类抗菌药物的耐药率普遍偏高;奶样中β-内酰胺酶耐药基因blaZ的检测试剂盒检出结果与同一奶样中分离菌株的药物敏感性试验结果一致率达58%(7/12)。综上所述,该检测试剂盒具有较高的准确度和病原覆盖率,可为牧场奶牛乳房炎主要病原的快速诊断和耐药基因(blaZ)监测提供有效的技术支持,从而降低抗菌药物的使用量,以减少牧场经济损失。

抗酸涂片与利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测在耐药肺结核诊断中的应用价值

目的探讨抗酸涂片与利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert MTB/RIF)检测在耐药肺结核(PTB)诊断中的应用价值。方法选取2020年3月至2022年3月福建省漳州市龙海区疾病预防控制中心收治的95例疑似耐药PTB患者作为研究对象。采集患者的纤维支气管镜肺泡灌洗液进行病原菌分离鉴定(阳性标本进行药敏试验)及抗酸涂片与Xpert MTB/RIF检测。比较病原菌分离鉴定和药敏试验、抗酸涂片及Xpert MTB/RIF检测的阳性率,并以病原菌分离鉴定和药敏试验结果为金标准,比较抗酸涂片、Xpert MTB/RIF检测对耐药PTB的诊断价值及与金标准的一致性。结果95例疑似耐药PTB患者病原菌分离鉴定和药敏试验阳性率为36.84%(35/95),抗酸涂片阳性率为29.47%(28/95),Xpert MTB/RIF检测阳性率为42.11%(40/95),差异有统计学意义(P<0.05)。以病原菌分离鉴定和药敏试验结果为金标准,Xpert MTB/RIF检测的诊断灵敏度、特异度、准确度均高于抗酸涂片,且与金标准的一致性高于抗酸涂片,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论抗酸涂片与Xpert MTB/RIF检测均对耐药PTB具有良好的诊断价值,但Xpert MTB/RIF检测的价值优于抗酸涂片。

结核杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术联合干扰素-γ释放试验对肺结核的诊断效能

目的探讨结核杆菌利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测(Gene Xpert-MTB/RIF)技术联合干扰素-γ释放试验(IGRA)对肺结核的诊断效能,为临床治疗提供参考。方法选取2022年3月至2024年3月睢宁县中医院收治的78例疑似肺结核患者的临床资料,进行回顾性分析。所有患者均接受结核分枝杆菌(MTB)培养、Gene Xpert-MTB/RIF、IGRA检查,以MTB培养结果为金标准,分析Gene X-pert MTB/RIF联合IGRA对肺结核的诊断效能。结果MTB培养结果显示:78例疑似肺结核患者中,阳性58例,阴性20例;联合检测结果显示:阳性72例,阴性6例。联合检测准确度为85.90%,灵敏度为94.83%,特异度为60.00%,阳性预测值为91.67%,阴性预测值为66.67%,均高于各项单一检测(均P<0.05)。结论Gene Xpert-MTB/RIF联合IGRA诊断肺结核的价值较高,值得临床应用。

荧光核酸适配体:核酸酶学分析新机遇

DNA和RNA的合成与降解等核酸代谢过程是维持生命体生长发育、新陈代谢、遗传变异、个体衰老等生命过程的基础代谢单元,广泛参与机体生命活动的全过程。核酸代谢相关酶活性对于维持细胞内环境的稳定性至关重要,其活性的改变可能会引起多种疾病的发生与发展。核酸代谢相关酶已成为多种疾病研究的重要靶点,也是生物技术和生物工程领域中不可或缺的重要工具,如聚合酶链反应、定点诱变、分子克隆和DNA测序等。因此,核酸代谢是所有核酸研究和相关生命科学领域研究的基础。本文将介绍核酸代谢的酶学分析常用方法,并聚焦于操作简单、实时快速的荧光法,按照荧光法的检测原理、发展历史和应用进行分类阐述与比较,并对核酸酶学分析工具未来研究与发展方向进行展望。

铟(Ⅲ)-8-羟基喹啉-核酸三元荧光体系的研究与应用

基于核酸对铟 ( ) - 8-羟基喹啉配合物的荧光增强作用 ,应用铟 ( ) - 8-羟基喹啉为荧光探针 ,研究了铟 ( ) - 8-羟基喹啉与核酸的作用 ,建立了新的核酸测定方法。在最佳条件下 ,ct DNA、hs DNA、sm DNA和y RNA的线性范围分别为 0 .2 0— 1.4 0 μg/ m L、0 .2 0— 1.6 0 μg/ m L、0 .10— 1.4 0 μg/ m L、0 .2 0— 1.2 0 μg/ m L,检出限 (3σ/ K)分别为 0 .0 0 4 μg/ m L,0 .0 0 2 μg/ m L,0 .0 0 2 μg/ m L,0 .0 0 2 μg/ m L;测定实际样品 ,回收率为90 .9%— 10 3.5 %。

核酸适配体荧光探针法和液基夹层杯法检测结核分枝杆菌临床应用价值比较

目的 比较核酸适配体荧光探针法和液基夹层杯法检测结核分枝杆菌(MTB)的临床应用价值。方法 采集175例肺结核患者和80名健康体检者的痰液样本,分别采用液体培养法、固体培养法、抗酸染色镜检法、液基夹层杯法、核酸适配体荧光探针法检测MTB。以液体培养法结果为标准,评价核酸适配体荧光探针法、液基夹层杯法与液体培养法结果的一致性。结果 与液体培养法结果比较,液基夹层杯法的敏感性为78.08%、特异性为98.04%;核酸适配体荧光探针法的敏感性为54.79%、特异性为50.98%。结论 液基夹层杯法与液体培养法一致性较好,具有较好的临床诊断价值;核酸适配体荧光探针法性能尚需优化。

荧光定量核酸扩增系统在肺结核及利福平耐药性检测中的应用价值分析

目的:探究荧光定量核酸扩增(Gene Xpert MTB/RIF)系统在肺结核及利福平耐药性检测中的应用价值。方法:选取2021年2月~12月本院收治的102例结核分枝杆菌感染的患者为观察组,对照组选取健康体检者50例。所有受试者接受Gene Xpert MTB/RIF系统分析、痰液酸性罗氏培养、痰液抗酸染色镜检。统计上述检测方法对核酸分枝杆菌的检出率,并分析Gene Xpert MTB/RIF系统在利福平耐药检测中的应用价值。结果:在观察组102例结核分枝杆菌感染患者中,Gene Xpert MTB/RIF系统全部检测出阳性,其中高级、中级、低级以及极低级结核分枝杆菌感染者分别为12例、30例、32例以及4例;总检出率同病原菌酸性罗氏培养检出的相符率为76.47%,同抗酸染色镜检出的相符率为57.84%。Gene Xpert MTB/RIF系统检测出利福平耐药16例,比例法药敏试验检测出利福平耐药19例,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Gene Xpert MTB/RIF系统对结核分枝杆菌的检测具有良好的准确率,能够有效提高检测效率,同时对利福平耐药基因的表达有一定的鉴别作用,在结核病的早期诊断、防治以及排查工作中具有较高的应用价值。

实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道生殖支原体感染的价值研究

探讨实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道生殖支原体感染的价值。方法 此次研究期间,对于所有的泌尿生殖道生殖支原体感染检测患者500例均以随机原则抽选自我院;选择时间下限为2021年4月,选择时间上限为2022年5月;其中230例为女性标本;270例为男性标本;对于所有患者有无呈现出支原体感染情况合理开展实时荧光核酸恒温扩增技术检测工作。之后就淋病奈瑟菌检测结果、沙眼衣原体检测结果以及解脲脲原体结果合理实施分析。结果 对于所有的泌尿生殖道生殖支原体感染检测患者500例均以随机原则抽选自我院;其中230例为女性标本;270例为男性标本。500例样本中,最终显示为阳性结果共计35例;其中男性标本共计23例,女性标本共计12例;同女性标本阳性率展开比较,男性标本阳性率存在有意义的差异(P<0.05)。对于本次研究的500例患者,进行尿液标本采集患者305例,对具体情况展开分析,25例所得结果为阳性;对于190例患者临床合理采集其分泌物标本,对结果展开分析,9例为阳性;5例患者同时对其展开尿液标本采集以及分泌物采集工作;1例获得阳性结果;阳性支原体感染患者共计35例,分别为23例男性以及12例男性。对应的单纯支原体感染例数分别为15例以及3例。男性单纯支原体感染患者比例较于女性单纯支原体感染患者比例更高(P<0.05);而对于阳性支原体感染患者共计35例,对于年龄≤20岁患者呈现出最高的感染率。以>20~30岁年龄段次之。在年龄逐渐增长后,对应的支原体感染率呈现出明显降低,存在有意义的差异(P<0.05)。结论 临床对于泌尿生殖道生殖支原体感染在实施诊断期间,实时荧光核酸恒温扩增技术呈现出较高的一致性,获得的临床效果较好。