HSP90β反义核酸载体转染细胞HSP90β蛋白的表达

目的了解HSP90β 反义核酸转染细胞中HSP90β蛋白的表达。方法通过lipofectamine介导将HSP90β反义核酸重组子pcDNA HSP90转染人胃癌细胞系SGC7901、人胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR、人肝癌细胞系HCC7402及人食管癌细胞系Ec109。经用G418进行筛选 ,对筛选出的阳性克隆用Westernblot检测HSP90β蛋白的表达。结果pcDNA HSP90转染人胃癌细胞系SGC7901 ,人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR ,人肝癌细胞系HCC7402及人食管癌细胞系Ec109后 ,用G418筛选出的阳性克隆 ,分别被命名为:AH SGC7901 ,AH SGC7901/VCR ,AH HCC7402及AH Ec109。Westernblot检测结果表明 ,AH SGC7901,AH SGC7901/VCR ,AH HCC7402及AH Ec109表达的HSP90β蛋白低于其亲本细胞。结论HSP90β反义核酸可封闭HSP90βmRNA ,使pcDNA HSP90转染的细胞AH SGC7901 ,AH SGC7901/VCR ,AH HCC7402及AH Ec109表达的HSP90β蛋白减少 ,为研究HSP90下调对肿瘤细胞生物学活性的影响提供了实验材料。

u-PAR反义核酸载体的构建与高侵袭人前列腺癌细胞PC-3M亚系的转染

目的 :为了特异封闭PC -3M高侵袭亚系尿激酶型纤溶酶原激活物受体 (u -PAR)的表达 ,观察其对侵袭能力的抑制效应。方法 :应用RT -PCR获得u -PAR的cDNA片段 ,反向插入pcDNA3质粒载体中 ,构建u -PAR反义核酸载体并导入高侵袭亚系中 ;借助RT -PCR和免疫组化检测转染细胞u -PAR的表达。结果 :u -PAR反义核酸载体转染株的u -PARmRNA和蛋白质水平明显低于对照组 ,抑制率分别为 53 %和 73 % ,同时其体外侵袭能力亦明显降低 ,抑制率为 79%。结论 :u -PAR反义核酸在PC -3M高侵袭亚系中发挥了特异封闭作用 ,为进一步观察u-PAR反义核酸抑制高侵袭前列腺癌细胞亚系的侵袭效应提供了细胞模型。

新型阳离子核酸载体的细胞转染效率研究

目的新型阳离子核酸载体LW13-2进行研究,分析其细胞毒性和基因转染效率,探讨其作为核酸载体的可能性。方法使用MTT比色法分析LW13-2与DNA在不同比例下的细胞毒性。选用绿色荧光蛋白表达质粒EGFP为报告基因,以人胚胎肾HEK293细胞为工具细胞,在荧光显微镜下观察计数,计算转染效率。结果当LW13-2与DNA的质量比为(1~3)∶1时,细胞毒性最低。LW13-2与DNA的质量比为3∶1时,转染作用4 h,在无血清培养基中继续培养48 h,得到LW13-2的最大转染效率为87.6%。结论通过与市售成熟转染试剂Lipofectamine 2000的对比,新型阳离子核酸载体在大幅提高基因转染效率的同时并没有增加其细胞毒性,有望成为核酸转移的有效载体,为相关研究及基因的靶向治疗研究提供基础。

纳米核酸载体和mRNA体外合成体系的构建

新型冠状病毒肺炎疫情给全球造成了严重的生命健康和经济损失。灭活疫苗和mRNA疫苗的上市给终结新型冠状病毒疫情带来了希望。2020年11月,Moderna公司公布其在研肿瘤mRNA疫苗对多种实体肿瘤取得了90%的疾病控制率。纳米核酸载体制备、mRNA体外合成是研发mRNA疫苗的两大关键技术。本文构建了简便的纳米核酸载体制备和体外mRNA合成体系,并对所制备纳米核酸载体的粒径,稳定性,电镜形态等进行了表征;以绿色荧光蛋白为测试基因验证了mRNA体外合成和纳米核酸载体对mRNA和DNA的细胞转染效率。该研究为进一步研发具有自主知识产权的病毒和肿瘤核酸疫苗奠定了基础。

器官靶向的聚合物核酸载体研究进展

核酸药物治疗在近年来得到了蓬勃发展,其有效治疗与核酸的安全、高效递送息息相关.一方面,核酸自身难以进入细胞表达,另一方面,与其他药物不同,一些核酸药物需要在特定器官/细胞上表达才能发挥疗效.因此其递送载体就显得尤为重要:它们既要保护核酸并实现高效转染,又要能够靶向特定部位以增加核酸在靶细胞的表达几率.鉴于聚合物载体是一类重要的核酸递送载体,因此在该综述中,主要总结聚合物核酸载体的研究进展,主要包括如何实现从给药部位到靶向部位的聚集、器官靶向核酸载体的研究现状,最后对聚合物核酸载体的器官靶向进行了展望.

畸胎瘤细胞源性生长因子反义核酸载体对高度恶性人卵巢癌细胞增殖和侵袭的抑制效应及相关机制

目的观察畸胎瘤细胞源性生长因子（PCDGF）反义核酸载体对高度恶性人卵巢癌细胞株Sw626和A2780增殖和侵袭的抑制效应，并初步探讨其相关机制。方法采用二苯基溴化四氮唑蓝（Mrrr）法和Boyden小室体外侵袭实验，检测PCDGF反义RNA真核表达载体对Sw626和A2780细胞增殖和侵袭能力的影响。采用Westernblot技术，检测转染PCDGF反义RNA真核表达载体前后Sw626细胞cyclin D1和CDK4蛋白表达的变化。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和明胶酶谱法，分析PCDGF反义RNA真核表达载体对Sw626细胞基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达和活性的影响。结果与空白对照组相比，PCDGF反义核酸载体转染组Sw626和A2780细胞的增殖抑制率分别为72．9％和70．9％，侵袭能力分别被抑制了62．9％和59．0％。转染组Sw626细胞cyclin D1和CDK4蛋白的表达水平分别为0．38±0．08和0．37±0．13，明湿低于空白对照组（0．84±0．11和0．64±0．11，P〈0．01）。与空白对照组（0．89±0．09）相比，转染组Sw626细胞MMP-2mRNA的表达水平（0．66±0．11）虽未见降低（P〉0．05），但MMP-2酶原的活性被明显抑制。结论PCDGF反义核酸可显著抑制高度恶性人卵巢癌细胞株Sw626和A2780的增殖和侵袭能力，并逆转其部分恶性表型，这可能与其能下调cyclin D1和CDK4蛋白的表达并抑制MMP-2酶原的活性有关；PCDGF可以作为卵巢癌治疗的新靶点。

1株asdA缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌作为核酸疫苗载体的构建与鉴定(英文)

目的利用载体-宿主平衡致死系统,将1株香港分离的野生型沙门氏菌(S129)构建为减毒核酸疫苗载体。方法以细菌生化反应和血清学方法鉴定S129为鼠伤寒沙门氏菌;以λ-RED同源重组方法靶向敲除S129株的asdA基因,并以卡那霉素抗性基因代替;通过菌落PCR鉴定后挑取阳性克隆asdA缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌(asdAΔS129),在含2,6-二氨基庚二酸(2,6-diaminopimelic acid,DAP)或无DAP的LB培养基中培养,与野生株S129对比生长曲线以验证asdAΔS129构建的成功;以S129和asdAΔS129攻击BALB/c小鼠验证asdAΔS129减毒情况;结果菌落PCR鉴定得到阳性克隆,asdAΔS129必需外源性添加DAP方能生长;asdAΔS129不能致死BALB/c小鼠,得到成功的减毒;结论成功将1株野生型沙门氏菌构建成asdA缺陷型减毒核酸疫苗载体,并在体外和体内实验中验证,为下一步的疫苗呈递和肿瘤治疗实验提供了合适的载体。

核酸自组装纳米递送载体的研究进展

随着核酸纳米技术的飞速发展,核酸自组装纳米载体已成为药物递送领域的研究热点。针对核酸自组装纳米载体在药物递送中的应用进展进行了系统综述,讨论了不同的核酸自组装策略,阐述了多种靶向递送和药物控制释放方法,同时,总结了核酸自组装纳米递送载体在蛋白质药物、核酸药物、小分子药物和纳米药物递送中的应用,并针对该领域的挑战和未来发展趋势进行了总结和展望,以期为药物递送领域和新型药物系统研究提供参考。

还原响应型嵌段共聚物自组装纳米胶束作为siRNA运输载体的研究

采用二重氢键为引导、双二硫键为连接单元的方法合成嵌段共聚物PEG2000-PLA3000-PEI1200-PLA3000-PEG2000,其自组装形成的纳米胶束可作为小干扰核糖核酸(siRNA)运输载体。采用核磁(1 H-NMR)、凝胶渗透色谱(GPC)、激光共聚焦显微镜(CLSM)等检测方法进行表征。结果表明:在二重氢键引导下合成嵌段共聚物,其自组装形成纳米胶束的临界胶束浓度(CMC)为0.052mg/mL,粒径为(32±0.1)nm,表面电势为(46.9±0.7)mV。负载siRNA的胶束粒径为(35±0.3)nm,表面电势为(27.2±1.1)mV。激光共聚焦显微镜的检测证明纳米胶束可携带siRNA进入细胞。

透明质酸修饰纳米粒在超声-微泡介导下的体外靶向性与安全性评价

目的制备一种由透明质酸修饰的纳米粒核酸递送载体(HDP@siRNA NPs),评价其生物安全性以及在超声-微泡介导下的体外转染靶向性。方法采用超声乳化溶剂挥发联合两步静电吸附法制备得到HDP@siRNA NPs,在透射电镜下观察其外观形态,测定其粒径、Zeta表面电位及体外稳定性,并检测siRNA的包封率及体外释放能力。荧光显微镜观察超声-微泡介导下纳米粒对肿瘤细胞的转染效果。通过CCK-8实验以及小鼠定期给药后的血清生化指标[肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肝脏的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转移酶(AST)、肾脏的血清肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)]检测及主要器官(心、肝、脾、肺、肾)病理切片分析验证纳米粒体内外生物安全性。结果成功制备出HDP@siRNA NPs,其在透射电镜下为形态均一的三层球形结构,粒径为(154.71±2.91)nm,Zeta表面电位为(-14.12±1.67)mV,并可长期稳定保存。该纳米粒载体对siRNA的包封率为(77.05±2.28)%,体外释放实验显示其具有缓释效果。靶向纳米粒联合超声-微泡组转染细胞后,Cy3荧光强度量化值为单独siRNA组的3.98倍(P<0.001),为非靶向NPs组的1.71倍(P<0.001),为靶向NPs组的1.39倍(P<0.001)。CCK-8结果显示,共孵育siRNA浓度为100 nmol·L^(-1)及150 nmol·L^(-1)时,HDP@siRNA NPs组细胞存活率依然维持在较高水平,并高于DP@siRNA NPs组(P<0.001),同时加入SonoVue共孵育对细胞存活率未产生明显影响(P>0.05)。对健康小鼠定期注射纳米粒及SonoVue微泡期间,给药结束后的血清生化检测结果显示,三组小鼠心、肾、肝功能基本指标水平差异均无统计学意义(P均>0.05),心、肾、肝未见异常损害情况。结论成功制备的由透明质酸修饰的HDP@siRNA NPs具有较高的生物安全性,在超声-微泡介导下其转染细胞效率得到进一步提升,具备作为新型核酸递送载体的潜力。

基于胶质瘤细胞来源胞外囊泡制作的仿生纳米材料在靶向递送STAT3-siRNA中的作用

目的:胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤,目前仍无理想的治疗手段,基因治疗作为胶质瘤治疗的新方法之一近年来备受关注,但因缺少有效的递送载体,从而使其在胶质瘤治疗中的应用仍十分有限。本研究旨在探讨用胶质瘤细胞来源胞外囊泡(extracellular vessel,EV)制作的仿生纳米材料靶向递送基因药物STAT3-siRNA来治疗胶质瘤的可行性。方法:首先通过超速离心法提取胶质瘤细胞U251来源的EV(U251 glioma cells derived EV,EV_(U251)),采用纳米粒子跟踪分析法对其粒径分布进行表征分析,透射电镜进行形貌分析,蛋白质印迹法验证其表面特征蛋白的表达;使用膜染料试剂盒PKH67将EV_(U251)标记后,通过细胞摄取实验验证其靶向U251的归巢能力;采用低渗法去除EV_(U251)的内容物,并通过微孔膜制备EV_(U251)囊泡(EV_(U251) memberane,EVM_(U251));采用电转染法将EVM_(U251)中载入靶向信号转导与转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)(STAT3-siRNA)制成仿生纳米材料EVM_(U251)@STAT3-siRNA;使用real-time PCR对成功包载的siRNA进行定量分析,并计算包载率及载药率;采用荧光染料CY5标记siRNA后,通过细胞摄取实验评价仿生纳米材料EVM_(U251)@CY5-siRNA靶向U251细胞的能力,再结合绿色溶酶体示踪剂评价该仿生纳米材料的溶酶体逃逸能力;最后通过体外细胞实验分别检测EVM_(U251)@STAT3-siRNA敲低STAT3 mRNA表达水平以及选择性杀伤U251的能力。结果:EV_(U251)粒径分布范围为50~200 nm,呈天然的圆盘形态,并且在其膜上检测到EV标志性蛋白质的表达。细胞摄取实验证明其具有靶向U251的归巢能力。将EV_(U251)制备为EVM_(U251)@STAT3-siRNA后,粒径变为(177.9±5.0)nm,siRNA包载率为(33.5±2.2)%。细胞摄取实验证明其仍具有靶向U251细胞的能力,且能成功避开溶酶体降解而将siRNA递送至胞质。体外细胞实验证明EVM_(U251)@STAT3-siRNA能有效敲低U251细胞STAT3基因的表达,并能对U251细胞产生选择性杀伤。结论:用EV_(U251)制作的仿生纳米材料EVM_(U251)@STAT3-siRNA能选择性敲低U251细胞STAT3基因的表达,并能产生选择性杀伤作用,可为胶质瘤的基因治疗提供新思路。

一种新型还原敏感型阳离子寡肽脂质的合成及其在模拟细胞质还原性环境中的降解动力学

目的:设计合成一种新型还原敏感型阳离子寡肽脂质材料,以期由其制得的脂质体可用作核酸药物载体在细胞质还原性环境促发下降解而释放药物。方法:以胱胺为原料引入二硫键,合成还原敏感型阳离子寡肽脂质材料H-SS-E2C14,并用其制备还原敏感型阳离子寡肽脂质体H-SS-E2C14-L;同时,以半胱胺为原料合成H-SS-E2C14的降解产物CS-E2C14,且采用HPLC法定量考察H-SS-E2C14在模拟细胞质还原性环境中的降解动力学。结果:合成的H-SS-E2C14在模拟细胞质还原性环境中的24h累积降解率约为70%。结论:H-SS-E2C14-L有望成为一种理想的基因药物载体。

聚合物载体在mRNA递送领域的研究进展

近年来,信使核糖核酸(mRNA)修饰与递送技术的突破推动了mRNA药物的蓬勃发展,尤其在疫苗、蛋白替代疗法和基因编辑领域展现出巨大潜力。然而,mRNA的不稳定性和负电荷特性使得研发安全、高效的递送系统成为关键。综述mRNA递送的聚合物载体研究进展,探讨提高mRNA转染效率的方法,包括聚合物结构优化和纳米颗粒工程化,概述聚合物器官靶向载体的研究现状,并对聚合物递送载体的临床应用进行展望。

磁共振对比剂标记的聚合物传输siRNA抑制基因表达

二乙烯三胺(DETA)修饰生物可降解的聚乙二醇(PEG)-聚天冬氨酸(PAsp)两嵌段聚合物PEGPAsp,并通过配体交换将PEG-PAsp(DETA)修饰到磁共振(MR)对比剂SPIO表面,阳离子嵌段PAsp(DETA)可负载核酸分子siRNA,从而获得兼具MR显像和核酸传输功能的生物可降解载体.细胞毒性研究证实该载体聚合物具有较好的生物安全性,可被肿瘤细胞高效吸收,且使转基因细胞株A549-Luc(恒定表达萤火虫荧光素酶)中荧光素酶的活性下调60%.MR成像也证实,SPIO经载体负载后,其横场弛豫率比游离的水溶性SPIO(WSPIO)提高了3倍以上,达到147 Fe(mmol/L)-1s-1,显著提高了磁共振的显像效果.

基于胺基与环氧的开环反应构建医用阳离子聚合物

近些年,阳离子聚合物在生物医用材料方面的研究与应用得到了广泛的关注.通过胺基与环氧的开环反应,可以得到伯胺、仲胺、叔胺等含氮阳离子,同时也会产生丰富的羟基,这赋予了所得聚合物优异的生物相容性以及穿透细胞的能力.本文主要就近些年来通过胺基与环氧的开环反应,所得到的基于乙醇胺功能化的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGEA)的阳离子聚合物和支化阳离子聚合物的构建策略,以及其在核酸递送、抗菌等方面的应用进行总结阐述.