荧光核酸适配体:核酸酶学分析新机遇

DNA和RNA的合成与降解等核酸代谢过程是维持生命体生长发育、新陈代谢、遗传变异、个体衰老等生命过程的基础代谢单元,广泛参与机体生命活动的全过程。核酸代谢相关酶活性对于维持细胞内环境的稳定性至关重要,其活性的改变可能会引起多种疾病的发生与发展。核酸代谢相关酶已成为多种疾病研究的重要靶点,也是生物技术和生物工程领域中不可或缺的重要工具,如聚合酶链反应、定点诱变、分子克隆和DNA测序等。因此,核酸代谢是所有核酸研究和相关生命科学领域研究的基础。本文将介绍核酸代谢的酶学分析常用方法,并聚焦于操作简单、实时快速的荧光法,按照荧光法的检测原理、发展历史和应用进行分类阐述与比较,并对核酸酶学分析工具未来研究与发展方向进行展望。

基于核酸适配体的纳米金淬灭罗丹明B荧光法检测氨苄青霉素

研究利用核酸适配体与氨苄青霉素的特异性结合效应以及纳米金对罗丹明B的荧光淬灭反应,通过改变反应体系荧光信号的强弱,从而实现氨苄青霉素的定量检测,建立了氨苄青霉素快速检测的新方法。最佳反应体系条件为适配体终浓度20nmol/L,盐溶液NaCl终浓度0.12mol/L,最优反应为温度30℃。在10mmol/L的3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲溶液(pH 6.0)的条件下,该方法可检测氨苄青霉素的浓度范围是0.494~2 000nmol/L,其最低检测限为0.494nmol/L,远低于国际相关检测标准。该方法具有检测时效性强、成本低廉、操作简便、反应灵敏等优点,有着良好的推广应用潜能。

基于非标记核酸适配体荧光法检测灌溉水中汞离子的研究

该文利用汞特异性核酸适配体和可以嵌入双螺旋脱氧核糖核酸中的荧光染料PicoGreen建立了一种快速检测汞离子的荧光分析方法。通过荧光信号强度来测定汞离子浓度,并获得了汞离子浓度的对数和荧光强度之间的线性关系。方法的线性范围为0.001~100μg/mL,检出限达到0.38 ng/mL。在As^(3+)、Pb^(2+)、Cd^(2+)、Cr^(2+)、K^(+)等干扰离子存在的情况下,具有很好的特异性。同时,在灌溉水实际样品检测中的回收率为95.2%~97.9%,相对标准偏差为2.3%~4.0%。该方法利用核酸适配体和荧光染料实现了对汞离子的痕量检测,是一种简单、快速、灵敏的测定方法。

核酸适配体传感器在血小板衍生生长因子检测中应用进展

血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor,PDGF)是一种低分子量碱性蛋白质,其中PDGF-BB亚型是诊断和识别癌症的重要生物标志物蛋白,与多种疾病的诊断相关,包含肝纤维化、动脉粥样硬化、老年性黄斑变性和糖尿病性眼病等。同时,PDGF-BB是一种具有多种生物学功能的细胞因子,被公认为伤口愈合和组织修复的药物。传统的PDGF-BB检测方法包括酶联免疫吸附法等在内的方法存在耗时长、成本高、仪器复杂等不足,限制了其实际应用。近年来,核酸适配体传感器以其高特异性、高灵敏度、低成本、响应速度快等优点在PDGF-BB检测方面引起科学家们越来越多的关注。综述了近年来检测PDGF-BB的核酸适配体传感器研究进展,以期为今后基于核酸适配体的PDGF-BB生物传感检测方法的设计提供参考。

变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)核酸适配体的SELEX筛选

变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼内脏白点病的主要致病菌。核酸适配体,因其亲和力高、特异性好等多个优点,在微生物检测等多个领域都有较好的应用前景。以变形假单胞菌为靶目标,采用SELEX筛选方法,从高频序列中筛选获得了变形假单胞菌的5个核酸适配体,测定了这些核酸适配体对变形假单胞菌的亲和特异性及其亲和常数(K_(d))和最大亲和力(A_(m)),并对其二级结构进行了分析研究。结果表明,这5个核酸适配体对变形假单胞菌的亲和力是其他非目标菌(嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、铜绿假单胞菌)的10倍以上,体现出了较好的亲和特异性。测定了5个核酸适配体(#1、#2、#3、#4、#5)的K_(d)和A_(m),相应的K_(d)值分别为(25.77±6.11)、(7.14±1.86)、(19.59±3.01)、(83.22±22.45)、(34.31±8.76) nmol/L,A_(m)值分别为(789.23±38.46)、(1392.27±58.03)、(3012.50±106.19)、(1457.99±171.32)、(1070.91±70.16) nmol/L。二级结构模拟发现核酸适配体对靶标的结合能力可能主要与其二级结构中的大中型环有关。相关研究对于变形假单胞菌的快速检测及其病害防控都具有重要意义。

核酸适配体功能化的稀土上转换纳米材料在生物检测中的应用

稀土上转换纳米材料可以吸收近红外光并发射出可见光或紫外光,在生物传感领域得到了广泛研究。核酸适配体能高特异性和高亲和性地与靶标物结合,被广泛应用于生物传感、疾病诊断等领域。将稀土上转换纳米材料与核酸适配体结合构建的检测体系,可实现对目标物灵敏、高选择性的检测。本文介绍了近几年核酸适配体功能化的稀土上转换纳米材料在生物小分子、蛋白质、核酸、病原微生物、细胞等方面的应用,并展望了其在分析检测领域的发展前景。

基于核酸适配体的DNA纳米结构在肿瘤研究中的应用进展

DNA纳米结构具有强大的分子载带量、良好的稳定性、可编辑性和生物相容性等特点,是纳米材料领域的研究热点。核酸适配体是一段短的寡核苷酸序列(RNA或ssDNA),能够折叠成特定的三维结构与靶标高特异性、高亲和力的结合。将核酸适配体的分子识别特性和DNA纳米结构相结合,可将靶向识别、生物成像及药物递送等特点集于一体,在生命科学研究领域,尤其是肿瘤领域,有着良好的应用前景。本文介绍了DNA纳米结构和核酸适配体的特点与优势,对近年来核酸适配体-DNA纳米结构在肿瘤标志物检测、靶向成像以及药物靶向递送的研究进展进行了综述,并对其发展前景进行了展望,期待核酸适配体-DNA纳米结构能为肿瘤的靶向诊疗提供新的策略。

RhD抗体ssDNA适配体结构分析

目的预测RhD抗体核酸适配体序列库中优势适配体,为实验室验证做准备。方法对以RhD抗体为目标靶分子而筛选出的适配体序列库做克隆测序;使用ClustalⅩ软件对阳性克隆子序列做同源性分析;使用DNA folding form在线分析工具对阳性克隆子碱基序列做最小自由能及二级结构分析。结果 RhD抗体28个阳性克隆子碱基序列按照基序的不同可分为3个家族,家族1和2中的适配体又可分为不同的亚家族;可形成由2-4个多分支环组成的二级结构,最小自由能在(-7.47--5.09)kcal/mol。结论 RhD家族1中的亚家族3和4适配体二级结构较为稳定,最小自由能较低,是RhD抗体适配体库中的优势适配体。

核酸适配体技术在生物样本物质检测中的应用研究进展

核酸适配体是通过体外筛选技术筛选出的单链DNA或RNA。其自身构象会随着与目标物质的结合而发生改变,与信号转换器结合后实现对物质高灵敏度、高特异性的快速检测。核酸适配体技术已经广泛应用于小分子、蛋白质、细菌病毒等方面的检测,尤其是环境和食品中重金属离子的检测。该文主要对核酸适配体技术应用于生物样本中物质检测的研究进展作一综述,并对其在生物样本中进行物质检测的前景进行展望,以期为其临床检验工作中的应用提供新思路。

石墨烯量子点荧光“开启”适配体传感器检测卡那霉素

该文开发一种基于结构转换适配体(aptamers)的新型高灵敏度荧光"开启"适配体传感器,用于快速、灵敏检测动物源性食品中卡那霉素(kanamycin,KAN)。适配体的结构转换诱导氮掺杂石墨烯量子点(nitrogen-doped graphene quantum dots,N-GQDs)的聚集/解聚行为,从而引起体系荧光的淬灭/恢复。与之前文献方法相比,该研究方法在效率、灵敏度、选择性和稳定性等方面均表现出优异性能:线性范围为0.1 ng/mL~10.0 ng/mL,检测限低至0.036 ng/mL(S/N=3),远远低于动物源性食品中KAN的最大残留限量。并且整个检测过程(包括样品提取)可在45 min内完成。此外,该方法成功用于5种动物源性食品样品(牛奶、蜂蜜、鱼、蛋、鸡肉)中KAN的检测。

核酸适配体介导的碳纳米管自组装

碳纳米管具有奇异的物理化学性能，独特的金属或半导体导电性、极高的机械强度、韧性、较大的比表面积、较好的吸附能力、催化特性和较强的微波吸收能力以及独特的孔腔结构、可用于多种高科技领域。单壁碳纳米管（SWNT）是构筑纳米材料的主要成分，它在电子学、光学、材料学、热力传播学及生物感应检测方面都有很大的潜质。但是SWNT要发挥它的性能，关键在于怎样将它组装成为可以达到目的的大分子结构。方法之一就是利用一些带有信息的分子来介导SWNT组装。在这些分子中，核酸适配体（Aptamer）由于其分子识别能力而被认为最具前景的选择。本工作针对DNA适配体对于SWNT自组装的介导作用进行了相关的研究。

基于Y型DNA结构和磁分离的荧光生物传感器同时检测Pb^(2+)和Cd^(2+)

多种重金属离子共存对人类健康和环境安全构成严重威胁,因此,建立灵敏、快速和可靠的分析方法尤为重要。将靶标识别元件——核酸适配体和DNAzyme与Y型DNA结构以及磁分离相结合,构建了一种能够同时检测食品中Pb^(2+)和Cd^(2+)的荧光生物传感器。核酸适配体和DNAzyme分别对Cd^(2+)和Pb^(2+)具有高度特异性,经巧妙设计所得的Y型DNA结构可实现对双目标物的同时检测,借助磁珠的固载和磁分离能力可进一步提高传感器的灵敏度。基于以上策略,开发了一种操作步骤简单、灵敏度高和稳定性好的新型荧光传感器分析方法,分别在0.5~100μmol/L和0.01~100μmol/L范围内对Pb^(2+)和Cd^(2+)具有线性响应,检出限分别为9.7 nmol/L和0.4 nmol/L。此外,相对标准偏差为3.3%~5.4%,实际样品中Pb^(2+)和Cd^(2+)的回收率为82.33%~107.25%。所制备的荧光生物传感器能够为重金属离子的多重检测提供一种有力的工具。

基于核酸适配体建立的小分子危害物检测技术研究进展

食品中小分子危害物污染是重要的食品安全问题之一,加强其污染水平监测十分必要,通常采用的仪器法和免疫分析法均无法实现对其的快速简便检测。核酸适配体作为抗体的替代分子,有制备周期短、易改造、亲和力高等优点,在食品中小分子危害物监测领域有着十分广阔的应用前景。目前基于核酸适配体建立的快速检测食品中小分子危害物的方法主要包括纳米金/荧光比色法、电化学传感法、酶联适配体法、时间分辨荧光法、荧光偏振荧光法、荧光共振能量转移法。本文综述了上述各方法的研究进展,并列出了各方法的优缺点,可作为实际检测中选择最合适方法的参考。

基于核酸适体检测黄曲霉毒素B 1的方法与高效液相色谱法的对比研究

对基于核酸适体酶联核酸适配体法(酶联适体法)、核酸适配体结构转换荧光法(适体转换荧光法)和高效液相色谱法(HPLC)检测黄曲霉毒素B 1进行对比研究。结果表明:当花生加标量为5、20、60μg/kg时,酶联适体法测得4.27、18.24、56.66μg/kg,适体转换荧光法测得4.95、21.05、65.00μg/kg,高效液相色谱法测得4.62、16.90、48.00μg/kg;当玉米加标量为5、20、60μg/kg时,酶联适体法测得4.05、17.34、50.79μg/kg,适体转换荧光法测得4.05、17.11、50.77μg/kg,高效液相色谱法测得5.10、16.33、44.98μg/kg。统计学分析结果显示,两种基于核酸适体的方法与高效液相色谱法两两之间无显著性差异(P>0.05),且酶联适体法的检测结果具有可视化,核酸适体结构转换荧光法更为直观快捷,为探索黄曲霉毒素B 1的快速检测方法奠定了基础。

DNA纳米结构用于肿瘤细胞生物传感和药物递送的研究进展

早期准确检测和诊断是癌症治疗成功的前提和关键。解决非特异性给药和耐药性是提高化疗效果的重要途径。DNA纳米结构是以DNA为材料,基于碱基互补配对原则,采用“自下而上”的精确设计所得到的二维或三维多种形状的纳米结构,现已逐渐应用于肿瘤领域。本文对近年来DNA纳米结构用于肿瘤细胞生物传感和药物递送方面的研究进展作一综述。

基于核酸适配体的上转换荧光纸基传感器用于测定茶水中的黄曲霉毒素B1

黄曲霉毒素大量存在于花生、玉米、稻米、大豆、小麦和茶叶中,其毒性、致癌力在霉菌毒素中都居首位,是对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素.本研究使用上转换纳米材料为荧光标记物,在其表面修饰可特异性地结合黄曲霉毒素B1的核酸适配体,构建出一种基于竞争法的荧光侧流试纸检测技术.该技术可实现对黄曲霉毒素B1的快速检测,在0.1～100 ng/mL的浓度范围内具有良好的线性度,最低检出限为0.03 ng/mL,并实现了对实际茶水样品的定量检测.该方法灵敏度高、特异性强、适用于现场的快速检测,具有良好的经济价值和应用前景.

稀土上转换发光纳米探针用于潜指纹中可卡因的检测

结合核酸适配体和稀土掺杂上转换纳米材料的优势,建立了一种潜指纹中外源性物质检测的新方法。Zeta电位、紫外吸收光谱和发光光谱表明核酸适配体成功修饰到上转换颗粒表面而且没有影响颗粒的发光性质。对含有不同量可卡因的指纹进行检测,在指纹中可卡因含量为0.5μg时仍能呈现出较强的发光强度。该方法能够通过潜指纹成像提供光学信号,实现潜指纹中外源性物质的检测,而且适用于不同人和不同基底上指纹的检测,具有简便、检测灵敏度高、适用性广等优点,对身份认证、刑事侦查和医疗诊断有重要意义。

新型核酸适配体荧光纳米微粒用于人干扰素-γ的测定

目的：利用由两条核酸适配体与人干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）的高亲和力构建的三明治结构和磁性纳米颗粒的磁性分离技术,设计并制作了一种新型荧光纳米微粒,建立基于核酸适配体的新型荧光纳米微粒用于人IFN-γ的检测。方法：流式细胞术检测IFN-γ核酸适配体B1-4和T2对IFN-γ的结合特异性;将生物素修饰的B1-4固定于链霉亲和素包被的纳米磁珠上,连接B1-4的纳米磁珠可通过B1-4与IFN-γ的亲和性捕获IFN-γ,再利用另一条FAM修饰的IFN-γ核酸适配体T2形成（B1-4）-（IFN-γ）-（T2）三明治夹心结构,构建新型核酸适配体荧光纳米微粒;IFN-γ分别与核酸适配体荧光纳米微粒孵育不同时间以探索该检测系统中IFN-γ与磁珠的最佳孵育时间;流式细胞术检测磁珠12 h内荧光变化,探索时间对检测体系的影响;流式细胞术检测与不同浓度IFN-γ孵育的磁珠表面荧光强度,绘制IFN-γ检测标准曲线;检测血清对检测特异性的影响。结果：B1-4和T2对IFN-γ的结合特异性高;三明治夹心结构对IFN-γ检测特异性好,任意改变其中一因素则磁珠表面荧光信号显著下降,三明治夹心结构构建失败;此法对IFN-γ的响应线性浓度为0~50 ng/L,其线性方程为y=3.512x＋1.060,敏感度为1 ng/L;12 h内测得的荧光信号稳定,并无明显衰减;血清对体系检测特异性无明显影响。结论：成功构建核酸适配体荧光纳米微粒用于人IFN-γ的测定。

核酸适配体功能化的脂质体负载上转换颗粒用于肿瘤靶向成像

核酸适配体是一类能够与靶标物高特异性地结合的寡核苷酸序列,可作用于金属离子、小分子化合物、蛋白质及细胞等.由于对靶标物具有高选择性,核酸适配体可赋予递送体系靶向特异性,同时增加递送药物及成像试剂在肿瘤组织内的富集,在分子诊断和体内靶向治疗等生物医学领域具有很大的应用潜能.本文基于聚丙烯酸(PAA)修饰的NaYF4:Yb/Er/Nd@NaYF4:Nd上转换纳米颗粒(UCNPs-PAA),将其封装于AS1411核酸适配体修饰的脂质体(Apt-Lip)中,构建了一种近红外(NIR)光激发的光学成像及靶向识别的UCNPs@Apt-Lip多功能纳米平台.透射电子显微镜、水合粒径、Zeta电势及共聚焦实验图表明成功制备了具有独特的核@空腔@壳构造的纳米体系.流式细胞仪和靶向细胞荧光共聚焦成像实验结果表明UCNPs@Apt-Lip材料对人乳腺癌细胞具有很强的靶向识别及荧光成像的能力.该多功能纳米平台具有上转换发光成像的可动核心,中空内腔和靶向壳层等独特性能,有望推动其在光催化纳米反应器、药物输送、肿瘤治疗等领域的发展.

基于MEMS技术的高纯度外泌体磁分离微流控芯片

基于CD63核酸适配体功能化磁珠捕获外泌体,设计和制作了一种可从胃癌细胞上清液中分离出高纯度外泌体的微流控芯片,芯片内磁增强微结构的梳齿间距40μm,最小宽度仅为20μm。利用COMSOL软件对磁增强微结构进行磁场仿真,结果表明最大磁感应强度和磁场梯度分别可达15.1 T和5.77×10^(4)T/m。通过纳米粒度Zeta电位仪对链霉亲和素磁珠与CD63核酸适配体偶联形成的功能化磁珠(SAMNP@Apt)进行表征,结果表明它们实现了良好偶联。使用SAMNP@Apt捕获外泌体,捕获效率可达92.7%。使用微电子机械系统(MEMS)技术制备了磁分离微流控芯片,并在微流控芯片中进行了外泌体磁分离实验,结果表明微流控芯片的外泌体分离纯度可达88.75%。