金黄色葡萄球菌核酸酶A在温控双表达载体中的表达及其活性分析

菌蜕制备时,金黄色葡萄球菌核酸酶A(Staphylococcal nuclease A,SNA)在温控单表达系统中表达时,对宿主菌的灭活效率比其在双表达系统中与基因E共表达时的灭活效率高近一个数量级。为探究导致这种差异的可能机制,将SNA克隆至一温控双表达载体进行诱导表达并对其活性进行综合分析。结果显示,胞内和胞外产物均具有核酸酶活性,分别在升温诱导30 min和90 min后被检出,对宿主菌的4 h灭活率为99.7%,宿主基因组亦被成功降解。这表明,SNA在温控双表达载体中的表达仍能如在单表达载体中一样有效灭活细菌,裂解基因E和SNA的共表达可能才是造成上述差异的主要原因。

猪链球菌2型分泌性核酸酶A(SsnA)活性检测及其基因序列的克隆与测序分析

对8株猪链球菌2型重庆分离株的核酸酶A全基因进行克隆测序,结果表明该基因长度为3 126 bp,与Gen-Bank发表的唯一的该基因的序列相比,核苷酸同源性高于98%,推导的氨基酸同源性高于94%。根据核酸酶A基因的测序结果建立扩增片段长度为301 bp的PCR检测方法,并用甲苯胺蓝DNA酶琼脂对猪链球菌分泌性核酸酶A的活性进行检测。检测了从病猪内脏分离的猪链球菌致病株35株,33株核酸酶A基因PCR检测阳性(阳性比例为94.3%),其中有24株分泌活性检测为阳性(阳性比例68.6%);正常猪扁桃体分离株14株,PCR检测为阳性的10株(阳性比例71.4%),其中有核酸酶A分泌活性为8株(阳性比例57.1%),检测菌株中有2型猪链球菌44株,38株扩增出核酸酶A基因的片段PCR检测阳性并且分泌活性为阳性的有32株,猪链球菌1型、7型、9型、13型、1/2型各1株,均能扩增出核酸酶A基因的片段,但只有13型猪链球菌有核酸酶A分泌活性。对猪链球菌在不同生长时期核酸酶活性的检测显示,猪链球菌在培养4、8、16、32、48 h均有核酸酶A的分泌,并且C a2+和M g2+为分泌性核酸酶A的活性必需因子。

金黄色葡萄球菌核酸酶A基因在大肠杆菌中的高效表达

这篇文章报道了金黄色葡萄球菌核酸酶A的克隆和在温控启动子P_RP_L调控下在E.coli中的高效表达。SDS-PAGE分析表明,核酸酶A的含量可占E.coli细胞总蛋白含量的60％。经有效的增溶和复性处理后,重组酶具有与天然酶相同的活力;N-末端氨基酸分析的结果指出,fMet在转译后被加工去除;对重组SNaseA在构象上的同一性也通过Phenyl-Su-perose疏水柱层析进行了分析。

MACC1的表达对宫颈癌Hela细胞凋亡特异核酸酶及细胞周期的影响

探讨MACC1的表达对宫颈癌Hela细胞凋亡特异核酸酶及细胞周期的影响。方法 将宫颈癌Hela细胞进行培养;扩增MACC1基因;检测MACC1、cyclinD1、MMP2、MMP9、caspase-3基因表达水平、凋亡特异核酸酶水平、Hela细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭水平以及Hela细胞的周期(G1期、S期、G2期)。结果 siRNA;MACC1组的MACC1、cyclinD1、MMP2、MMP9基因表达水平低于siRNA;NC组;caspase-3基因表达水平高于siRNA;NC组(P<0.05)。siRNA;MACC1组的Hela细胞中凋亡特异核酸酶水平为(1.85±0.18);显著高于siRNA;NC组(1.01±0.09)(P<0.05)。siRNA;于细胞侵袭及细胞迁移数量和Hela细胞A值、等方面,相比siRNA,MACC1组更低;NC组;细胞凋亡率高于siRNA;NC组(P<0.05)。siRNA;MACC1组的Hela细胞中G1期细胞比例高于siRNA;NC组;S期细胞、G2期细胞的比例低于siRNA;NC组(P<0.05)。结论 MACC1的表达能够改善宫颈癌Hela细胞的凋亡特异核酸酶水平,调控细胞周期,将Hela细胞阻滞在G1期,诱导细胞凋亡。

核酸酶基因LoENDONUCLEASE1在东方百合花朵衰老过程中的功能分析

为明确百合(Lilium spp.)花朵衰老发生的分子机制,在东方百合‘西伯利亚’(Lilium oriental hybrid‘Siberia’)花被片中克隆了一个衰老相关基因LoENDONUCLEASE 1(SAG10),利用qRT-PCR进行基因表达分析,并通过农杆菌介导的拟南芥稳定表达系统和百合花被片瞬时表达体系验证LoENDONUCLEASE 1基因功能。结果显示,LoENDONUCLEASE 1基因开放阅读框(ORF)为921 bp,编码306个氨基酸;LoENDONU⁃CLEASE 1在百合花朵和叶片的衰老过程中特异表达,且受到脱落酸和水杨酸的诱导;拟南芥过表达LoENDO⁃NUCLEASE 1株系中叶片叶绿素含量显著低于对照株系,百合花被片中瞬时过表达LoENDONUCLEASE 1基因加速了百合花被片的衰老,且过表达花被片中丙二醛和离子渗透率含量显著高于对照。结果表明,LoEN⁃DONUCLEASE 1具有促进花朵和叶片衰老的功能。

核酸酶NucB高效表达工程菌株的构建及功能测定

目的构建可以高效稳定表达核酸酶NucB的工程菌株。方法以大肠杆菌DH5α(DE3)为材料,采用基因编辑的方法将其中的必需基因lexA敲除,重新设计一个带有lexA基因的质粒进行基因回补,从而得到工程菌株DH5α(DE3)ΔlexA,再将带有目的基因nucB的质粒转入基因改造后的菌株中发酵培养生产核酸酶NucB并测定功能。结果经过基因改造后的大肠杆菌DH5α(DE3)ΔlexA与未经基因改造的大肠杆菌对比显示:改造后的菌株质粒非常稳定,蛋白表达量高且发酵过程中可以不用添加抗生素来生产核酸酶NucB。结论以基因编辑的方法成功构建一株无抗生素、高效稳定表达核酸酶NucB的工程菌株DH5α(DE3)ΔlexA。

新一代基因编辑工具 无须蛋白核酸酶参与

创新点,基因承载着遗传信息,塑造了生命的多样性和复杂性。基因编辑作为一项关键技术,在生物学研究和生物医药产业的发展中具有至关重要的地位,是我们深入了解和改变生命的关键工具。历代基因编辑工具,ZFNs、TALENs、CRISPR-Cas均高度依赖蛋白质。

阴离子交换树脂固定化核酸酶P1的研究

5′-核苷酸及其衍生物因具有较高的营养保健价值和药用价值,市场需求不断增大。核酸酶P1是目前5′-核苷酸工业生产的关键酶,但游离酶存在难以重复利用、消耗量过大等缺点。为了解决上述问题,提高核酸酶的利用效率,笔者利用不同类型树脂对核酸酶P1进行固定化。以核酸酶P1的吸附量和固定化酶的酶活为评价标准,研究发现阴离子交换树脂1(AER1)固定化时效果最佳,优化后的最佳固定化条件为酶量3 644.7 U/mL(2.2 mL)、戊二醛质量分数0.25%、交联时间1.5 h、固定化时间10.0 h、pH 5.1。该条件下制备的核酸酶P1的比酶活为47 980.95 U/g。在此最佳条件下,固定化酶的热稳定性有一定程度的提高;固定化酶的酸碱稳定性大幅度提高;固定化酶在4℃下保存6周后,酶活保留51.8%,是游离酶的1.6倍。

葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1/SLC7A11抑制铁死亡对骨肉瘤发生发展的影响

目的探讨葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1(SND1)对骨肉瘤细胞生物学功能的影响,及其通过SLC7A11调控骨肉瘤细胞铁死亡的作用机制。方法检测人成骨细胞hFOB1.19以及骨肉瘤细胞系Saos-2、U2OS、HOS和143B中SND1的表达水平。采用小干扰RNA敲减骨肉瘤细胞HOS和143B中SND1的表达(si-SND1),采用CCK8法、细胞克隆形成实验、细胞迁移和侵袭实验探究SND1的表达对骨肉瘤细胞生物学功能的影响;调控骨肉瘤细胞中SND1以及SLC7A11基因的表达,探究SND1通过SLC7A1基因对骨肉瘤铁死亡介导的肿瘤细胞凋亡的影响。结果骨肉瘤细胞Saos-2、U2OS、HOS和143B中SND1 mRNA和蛋白的表达水平显著高于人成骨细胞hFOB1.19(P均<0.01)。与对照组比较,si-SND1转染显著降低HOS和143B细胞中SND1的表达水平(P均<0.01),且细胞活性显著降低,克隆形成数量显著减少,细胞迁移和侵袭能力显著降低(P均<0.001)。铁死亡诱导剂Erastin促进骨肉瘤HOS和143B细胞凋亡,而抑制剂Ferrostatin-1刺激上调细胞活性(P均<0.001)。敲减SND-1后使用Erastin可进一步降低骨肉瘤HOS和143B细胞活性,而使用Ferrostatin-1刺激后可显著恢复细胞活性(P均<0.001);Erastin处理后,si-SND1组细胞中铁离子和丙二醛表达增高,谷胱甘肽表达降低(P均<0.001)。体内实验结果显示,敲减SND1可以明显抑制143B裸鼠移植瘤的瘤体质量(P<0.001)。敲减SND1后骨肉瘤HOS和143B细胞中SLC7A11的表达水平显著减少(P均<0.001),且铁死亡水平升高(P<0.001,P=0.020)。结论骨肉瘤细胞中SND1表达显著增高,其可能通过上调SLC7A11的表达抑制铁死亡,进而促进骨肉瘤细胞活性。

基于核酸酶辅助信号放大的2’-O-甲基修饰分子信标用于高灵敏和特异性外泌体肿瘤microRNA分析

外泌体是新兴的重要癌症生物标志物。有效检测外泌体和外泌体内容物,特别是microRNA (miRNA),对于癌症的诊断和治疗是迫切且具有挑战性的。基于双链特异性核酸酶(Duplex specific nuclease, DSN)的特异性识别和消化能力,我们设计了一个2’-O-甲基修饰的分子信标(2’-O-methyl-modified molecular beacon, omMB),并开发了一个高灵敏度和特异性分析外泌体miRNA的信号放大检测平台。该方法以A375细胞分泌的外泌体为模型,以microRNA-21 (miR-21)为模型miRNA分子,可以检测到低至37.9 pM的miRNA和2 μg/mL的裂解外泌体。同时,与许多已开发的DSN辅助信号放大方法相比,新方法具有较高的特异性,可以区分错配miRNA。总之,这项工作为医学分析、临床应用和疾病诊断中的外泌体检测提供了一种有效的分析策略。

家蚕RNAi效率相关核酸酶基因对RNAi效率的影响

【目的】鳞翅目(Lepidoptera)昆虫消化系统存在的核酸酶是导致RNAi低效的主要原因之一,本研究旨在探索家蚕Bombyx mori RNAi效率相关核酸酶(RNAi efficiency-related nuclease, REase)BmREase对家蚕RNAi低效的影响。【方法】利用RT-PCR对家蚕BmREase cDNA全长序列进行同源克隆和生物信息学分析,并采用最大似然法进行系统发育分析;利用qRT-PCR检测BmREase在游走期家蚕不同组织(头、表皮、脂肪体、中肠、气管、马氏管和丝腺)中的特异性表达。通过向游走期家蚕注射BmREase,家蚕蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)基因BmEcR,超气门蛋白(ultraspiracle, USP)基因BmUSP和细胞因子sp?tzle1(BmSpz1)基因BmSpz1的dsRNA进行RNAi,分析干扰BmREase表达后是否可以提高靶基因dsRNAs的干扰效率。【结果】RT-PCR扩增得到家蚕BmREase(GenBank登录号:XM_021350017.2)全长cDNA序列,其ORF长2 241 bp,编码746个氨基酸残基;生物信息学分析发现,BmREase与人核酸外切酶I 3qe9.1具有极其相似的结构,其Thr7, His33, Ala37, Arg93, Lys97, Tyr159, Asp160, Ser161和Asn174组成的活性结构域能够与核苷酸序列结合,暗示BmREase具有核酸酶活性。qRT-PCR结果显示,BmREase在家蚕游走期的中肠和马氏管中高表达,说明BmREase主要在家蚕消化系统中表达。在家蚕游走期注射dsRNA,BmREase的表达量比空白对照组的高,RNAi干扰BmREase提高了dsBmEcR, dsBmUSP和dsBmSpz1的干扰效率。【结论】家蚕体内存在与人类核酸外切酶相似功能的酶BmREase,其存在可能影响dsRNA在家蚕体内的干扰效果。本研究为利用RNAi进行家蚕基因功能的研究以及进一步开发RNAi防治害虫具有指导性意义。

核酸酶在酱油酿造上的应用研究

该研究采用低盐固态酱油发酵工艺,采用单一菌株(米曲霉3.042)进行制曲,在制曲过程中添加核酸酶来实现酶法辅助发酵。采用单因素实验确定核酸酶的最佳添加量和添加时间。通过测定酱醅的总酸、氨基酸态氮等理化指标以及成品酱油中的风味成分,最后进行成品酱油的感官评定,探讨外源核酸酶在酱油酿造中的作用。结果表明,核酸酶的最佳添加量为大曲质量的0.3%。同时核酸酶的添加提高了大曲的酶活,保证了原料中大分子物质的分解和有效利用,从而具有提高酱油原料利用率和改善酱油风味的效果。

腺相关病毒介导锌指核酸酶体外切除HIV-1基因组研究

人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus type 1,HIV-1)能够整合到宿主细胞基因组并通过基因沉默的方式逃避高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antietroviral Therapy,HAART),而高效特异性的基因编辑工具的出现,有望成功切除HIV-1前病毒基因组。重组腺相关病毒(AAV)是基因治疗的重要载体系统,为了获得能够高效感染T细胞的基因编辑工具递送系统,本研究通过比较过表达增强绿色荧光蛋白的血清型2、血清型6、血清型DJ的重组腺相关病毒,筛选出T细胞系的偏好血清型为6型。通过比较CMV启动子、SFFV启动子,筛选出T细胞系的偏好启动子为SFFV启动子。最后,我们通过制备过表达靶向HIV-1长末端重复序列(Long Terminal Region,LTR)的锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease,ZFN)的AAV6递送载体系统,感染模拟HIV-1阳性表达的细胞系Ya,T7E1检测证实HIV-1前病毒基因组被特异性切除,流式细胞仪检测证实切除效率约为17.1%,测序分析进一步证实靶向HIV-1 LTR的ZFN能介导从细胞基因组中切除HIV-1前病毒基因组。实验证明,6型重组腺相关病毒递送靶向HIV-1 LTR的ZFN能有效切除HIV-1前病毒基因组,为该系统未来的体内应用奠定了基础。

基于双链特异性核酸酶水解信号放大检测miRNA的方法学进展

微小RNA(miRNA)作为肿瘤等多种疾病相关的一类核酸标志物,在疾病早期或预后阶段水平极低,需要提高miRNA检测灵敏度。双链特异性核酸酶(DSN)是近年来新发现的一种特异性水解DNA-RNA杂交链中DNA、而对单链RNA不产生作用的核酸酶;利用其酶切特性可导致miRNA循环再利用,从而实现miRNA检测信号放大。目前基于DSN酶切放大效应检测miRNA为一项热点研究,其与等温扩增及纳米材料相结合,主要在DSN介导的比色传感器、荧光传感器、电化学及电化学发光传感器等方面发展出许多miRNA检测新方法,为医学检验工作者提供了极具前景的miRNA技术工具。巧妙设计DNA探针、克服DSN部分局限性、增加新型纳米材料等则是基于DSN酶切放大效应检测miRNA新方法的未来研究发展方向。

裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体的构建及大肠杆菌菌影的制备

目的构建噬菌体裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体,制备高质量的大肠杆菌菌影。方法自行设计一对引物,PCR扩增PhiX174噬菌体裂解基因E,将该基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建大肠杆菌菌影的表达载体pGEX-E。在E基因基础上与辅助基因葡萄球菌核酸酶A(SN)基因串联,并插入pGEX-6P-1载体,构建双基因串联高效表达载体pGEX-E-5aaLinker-SN和pGEX-E-15aaLinker-SN,采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,制备大肠杆菌菌影。结果裂解基因E单基因及串联基因已成功插入融合表达载体pGEX-6P-1,所构建的大肠杆菌菌影表达载体pGEX-E、pGEX-E-5aaLinker-SN和pGEX-E-15aaLinker-SN,诱导后经透射电镜及活菌计数显示大肠杆菌已发生不同程度裂解,制成了大肠杆菌菌影。电镜下菌影形态完整,内容物已释放到胞外。结论已成功构建了噬菌体裂解基因E单基因及裂解基因和核酸酶基因串联基因表达载体,并制成了大肠杆菌菌影,为进一步研究菌影这一新型的疫苗及佐剂形式奠定了基础。

金黄色葡萄球菌核酸酶A与不同外源DNA片段融合表达的作用比较

金黄色葡萄球菌核酸酶A(Staphylococcal nuclease A,SNA)可用于菌蜕制备中宿主菌的进一步灭活及残存遗传物质的去除。关于SNA在去除了信号肽后是否仍能分泌至胞外以及是否需要融合其他氨基酸片段才能在宿主菌胞质中发挥作用尚存争议。为厘清这一争议,分别构建一系列含SNA、SNA与λ噬菌体cro基因或结核杆菌脲酶基因部分序列的融合片段c SNA或u SNA的温控质粒并对其在大肠杆菌内的作用进行评价。结果显示,SNA、c SNA和u SNA的表达产物对大肠杆菌的4 h灭活率分别为99.9%、99.8%和74.2%。升温诱导30 min后,SNA和c SNA即可在宿主菌胞内被检出,而u SNA需1 h;相较之下,SNA和c SNA在培养液上清中的被检出时间要晚1 h,u SNA则晚2 h。对三者的核酸酶活性检测均为:SNA﹥c SNA﹥u SNA,且胞外活性都显著低于胞内。此外,SNA和c SNA在诱导2 h后即将宿主基因组成功降解,而u SNA则在整个实验期间均未能使宿主基因组完全降解。这表明SNA、c SNA和u SNA的表达产物均具有核酸酶活性,可被动释放至胞外,外源DNA片段的融入反而会降低SNA的核酸酶活性。

粘质沙雷氏菌全能核酸酶的研究进展

全能核酸酶又称非特异性核酸酶(Nonspecific nuclease,NU),可降解几乎所有形式的DNA和RNA (包括单链、双链、线状、环状、天然以及变性的核酸),生成3~5个碱基长度的5’-单磷酸寡核苷酸。全能核酸酶来源广泛,在动物、植物、细菌、真菌和病毒均有发现,到目前为止,已鉴定出30多种不同来源的全能核酸酶,其中来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的全能核酸酶活力最强(下文无特殊说明,全能核酸酶均指来源于粘质沙雷氏菌全能核酸酶),能够在非常广泛的条件下保持很高的稳定性和消化活力。全能核酸酶在兽医方面的应用主要是去除兽用疫苗、蛋白、多糖类生物制药生产过程中的核酸残留,降解动物性饲料中的病原体的核酸残留,维护养殖场的生物安全。

人工锌指核酸酶介导的基因组定点修饰技术

锌指核酸酶(ZFN)由锌指蛋白(ZFP)结构域和Fok I核酸内切酶的切割结构域人工融合而成,是近年来发展起来的一种可用于基因组定点改造的分子工具。ZFN可识别并结合特定的DNA序列,并通过切割这一序列的特定位点造成DNA的双链断裂(DSB)。在此基础上,人们可以对基因组的特定位点进行各种遗传操作,包括基因打靶、基因定点插入、基因修复等,从而能够方便快捷地对基因组实现靶向遗传修饰。这种新的基因组定点修饰方法的突出优势是适用性好,对物种没有选择性,并且可以在细胞和个体水平进行遗传操作。文章综述了ZFN技术的研究进展及应用前景,重点介绍ZFN的结构与作用机制、现有的靶点评估及锌指蛋白库的构建与筛选方法、基因组定点修饰的策略,以及目前利用这一技术已成功实现突变的物种及内源基因,为开展这一领域的研究工作提供参考。

类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术

人工构建的序列特异性核酸内切酶能够识别并切割特定的DNA靶序列,造成双链断裂,从而引起基因组结构的定点改变。人工核酸内切酶技术使得研究人员有可能对任意物种的基因组进行定点修饰,开启了反向遗传学研究的新天地。类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)自2010年底开始成功应用于基因打靶,很快成为一种比锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)更容易设计、特异性更高和毒性更低的人工核酸内切酶。文章综述了TALEN技术的研究进展及应用前景,重点介绍TALEN的结构、作用机制与构建方法和利用TALEN进行基因组定点修饰的策略,以及目前利用这一技术已成功实现突变的物种及内源基因,特别是在斑马鱼中的应用,为开展这一领域的研究工作提供参考。

磺酸咔咯及其镓(Ⅲ)配合物与DNA的相互作用和光核酸酶活性

本文用紫外-可见光谱、荧光光谱、圆二色光谱和粘度法研究了2,17-二(磺酸钠基)-5,10,15-三(五氟苯基)咔咯(1)及其镓配合物(1-Ga)与小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用。结果表明1和1-Ga通过外部结合的方式与ct-DNA相互作用,且结合能力1-Ga比1大。琼脂糖凝胶电泳实验显示1和1-Ga均具较好的光核酸酶活性,1-Ga光断裂DNA效果比1好,其光断裂机理与羟基自由基的产生有关。