限制性核酸内切酶Asc I蛋白质的表达纯化、酶活测定及小角散射结构解析

限制-修饰系统(RMS)是细菌为了防御外来DNA入侵而进化产生的一种保护机制。RMS系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。Asc I是一种Ⅱ型限制性核酸内切酶,能识别8-bp DNA基序。尽管Asc I已经被广泛应用于分子克隆研究中,然而目前尚无关于Asc I蛋白质的表达、纯化以及结构机制等方面的研究报道。本研究基于大肠杆菌重组表达体系建立了Asc I重组蛋白质的高效表达和纯化方法,从每升细菌培养物中可获得约2.5 mg纯度大于95%的Asc I蛋白质。进一步的酶学性质研究表明,Asc I酶切反应的最适温度是37℃,最适pH为7.5~8.5,反应依赖于Mg^(2+)和Mn^(2+)等二价金属离子。基于小角X射线散射(SAXS)分析技术,我们还建立了Asc I蛋白质及其与底物DNA复合物在溶液状态下的三维空间模型,并结合点突变对该模型进行了验证。总之,本研究对Asc I蛋白质的重组表达、纯化、酶活性质以及结构机制进行了比较系统地研究,为了解RMS系统的工作机制提供了结构基础,同时也为Asc I作为分子克隆工具酶的进一步开发和改造提供了理论依据。

伤寒沙门菌质粒pR_(ST98)的限制性核酸内切酶分析

目的 以我国特有的多重耐药伤寒沙门菌中分离的质粒pRST98为研究对象 ,对其除编码细菌抗药性外还能使宿主菌毒力增强这一独特性状产生的分子基础 ,用限制性核酸内切酶进行核酸酶谱分析。方法 将质粒pRST98用QIAGEN试剂盒提纯并精确定量后 ,选用常用的 9种限制性核酸内切酶消化 ,制作该质粒的酶切图谱。结果 用试剂盒提纯质粒 ,再用限制性内切酶消化后得到了清晰、准确的质粒酶切图谱 ,其中BglⅡ、EcoRⅤ、PstⅠ和SacⅡ是对该质粒进行分子生物学和分子流行病学研究的理想工具。结论 伤寒沙门菌多效性质粒 pRST98限制性核酸内切酶谱的建立 ,为分析该质粒的遗传特征、流行病学追踪和基因功能定位奠定了基础。

两步亲和层析纯化限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ

以Bacillussphaericus63为材料 ,采用DNA Sepharose4B和CibacronBlueF3GA Sepharose4B两步亲和层析 ,分离纯化得到电泳均一纯限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ .酶的得率约为 1 3 0单位 /g湿菌 ,比活力高达 61 4 0 0单位 /mg蛋白 .还报道了DNA -Speharose 4B两种亲和吸附剂制作方法的改进 .

限制性核酸内切酶PstⅠ活性基团的研究

分别以N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、2,3-丁二酮和N-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸盐作修饰剂,研究色氨酸、精氨酸残基和羧基对PstⅠ活性的影响.结果表明,NBS的修饰虽可导致PstⅠ活性丧失,但紫外吸收光谱和SDS-PAGE研究结果表明色氨酸残基并非PstⅠ的活性基团,而精氨酸残基和羧基的修饰可导致PstⅠ和PstⅠ*活性丧失,并按Keech和Farrant动力学方法分析得出无论在原活性还是星号活性条件下,有一个精氨酸残基和两个羧基是PstⅠ的活性基团.

限制性核酸内切酶Bsp63I的部分性质研究及与其同工酶的比较

纯化至电泳均一纯的限制性核酸内切酶Bsp6 3I经SephadexG - 2 0 0测得相对分子质量约为 113 80 0 ,SDS-聚丙烯酰凝胶电泳测得其亚基相对分子质量约为 5 6 80 0 .用DNS法测得该酶N -末端氨基酸为丙氨酸 ,表明该酶由 2个相同的亚基组成 ,还对Bsp6

牛摩拉氏菌中国地方株限制性核酸内切酶的提取与纯化

目的 :为探讨牛摩拉氏菌中国地方株MABL80 11限制酶的存在。方法 :采用改进的GelinasRE等方法对MABL80 11菌株的培养物分别进行超声裂解、离心、盐析、BioGel A0 .5M和磷酸纤维素P11柱层析 ,获得可切割λDNA和pBR332DNA与国际标准酶MboI切点一致的酶提取物。结果 :在改进的条件下 ,30 0 0ml培养物 ,可获得 72 0 0UMboI,纯化率为 2 3.2 % ,酶产出量高于文献报导值。结论 :表明牛摩拉氏菌中国地方株MABL80 11确含MboI限制性内切酶 。

限制性核酸内切酶的制备、纯度鉴定和测活方法

限制性核酸内切酶(简称限制酶)主要来源于细菌,其分布广泛、种类繁多。第一个限制酶于1968年问世,迄今已发现了近500种,其中绝大部分是Ⅱ型限制酶。Ⅱ型酶是非常重要的工具酶,被誉为“分子手术刀”;也为研究两类最重要的生物大分子——蛋白质和核酸的相互作用提供了一个理想的模型。

限制性核酸内切酶及其显带研究进展

介绍了核酸内切酶及其在基因工程中的应用,综述了人染色体、其它生物染色体显带概况,并对内切酶的显带机理进行了探讨.

一步法分离纯化限制性核酸内切酶BamHI

本文提出了一个迅速简便纯化BamHI的方法,即一步肝素——琼脂糖亲和层析法。

限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ的纯化及性质研究

用Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ６３菌为材料，经ＤＮＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅＦ３ＧＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ两步亲和层析，将Ｂｓｐ６３Ⅰ纯化到均一程度。酶比活力达６１４００Ｕ／ｍｇ蛋白。用凝胶过滤法测得该酶分子量为１１３８００。该酶样品在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中呈现为一条蛋白带，并测得其亚基分子量为５６８００。用ＤＮＳ－Ｃｌ法测得该酶Ｎ－末端氨基酸为丙氨酸。上述结果表明该酶分子是由两个相同亚基组成。

基于DNA和限制性核酸内切酶的基本逻辑门设计

由于DNA分子具有特异性、高并行性、微小性等天然特性,在信息处理过程中展现出了强大的并行计算能力和数据存储能力。该文研究将具有特异性识别功能的限制性核酸内切酶引入DNA链置换反应中,作为DNA电路的输入,通过控制立足点的生成和移除设计了是门、非门和与门3种基本逻辑门。采用Visual DSD对逻辑模型进行模拟仿真,并通过凝胶电泳实验验证设计。与以往的分子逻辑门比较,该设计反应迅速,操作简便,具有良好的扩展性,为大规模电路的设计提供了可能性。

限制性核酸内切酶

本文综述了限制性核酸内切酶的种类、性质、制备方法、活力和纯度测定方法及其在分子生物学方面的应用。

一组与限制性核酸内切酶有关的疑难问题分析

限制性核酸内切酶,又称限制酶,是一类可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列,并对每条主链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的酶,简称限制酶。根据限制酶的结构,辅助因子的需求切位与作用方式,可将限制酶分为三种类型:Type Ⅰ、Type Ⅱ及Type ID。Ⅰ型限制酶既能催化宿主DMA的甲基化,又催化非甲基化的DNA的水解;Ⅱ型限制酶只催化非甲基化的DNA的水解;瓜型限制酶同时具有修饰及认知切割的作用。由于Ⅱ型限制酶所识别的位置多为短的回文序列,所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列,所以是基因工程上实用性较高的限制酶种类,如,EcoRⅠ、HindⅢ。

产青霉素酶淋病奈瑟球菌耐药质粒的提取与酶切分析

目的 了解产青霉素酶淋病奈瑟球菌 (PPNG)在本地区的分布状况及其耐药质粒的限制性核酸内切酶长度多态性分析。方法 用碘量法筛选PPNG株 ,碱变性法进行质粒抽提 ,回收 7.4kb及 5 .4kb质粒进行酶切分析。结果 6 8株临床分离株筛选出PPNG菌 3株 ,经限制性核酸内切酶长度多态性分析 ,PPNG菌 7.4kb及5 4kb质粒含有BamHⅠ的双酶切位点 ,7.4kb质粒含有PstⅠ及HindⅡ单酶切位点。结论 PPNG菌株的筛选及耐药质粒的酶切分析为追踪耐药菌株的流行趋势提供了流行病学信息。

酵母质粒PCR扩增及酶切在酵母双杂交中的运用

目的:减少对初步筛选获得的阳性克隆进一步鉴定的工作量,防止阳性克隆的丢失。方法:提取酵母双杂交筛选cDNA表达文库获得的阳性克隆酵母细胞质粒,以文库载体插入片段两端特异序列为引物,PCR扩增插入片段,限制性核酸内切酶酶切扩增产物,琼脂糖凝胶电泳,根据带型对阳性克隆进行分类。结果:将初步获得的107株阳性克隆,分为24类,在PCR扩增过程中发现个别克隆含有两种以上的文库质粒。结论:酵母质粒PCR扩增,酶切分类的方法,不仅可以大大减轻阳性克隆进一步鉴定的工作量,避免不必要的浪费,而且还可以避免阳性克隆的丢失。

西门塔尔牛的限制酶显带

本文采用限制酶HinI、AluI分别处理西门塔尔牛的中期染色体18小时。AluI产生部分C带和部分G带;Hinf产生G带和部分C带。

含新限制酶微生物现踪贝加尔湖

俄罗斯研究人员最近在贝加尔湖中发现了一些微生物突变种，其体内含有以前未发现的限制性核酸内切酶，能够将进入微生物体内的外来病毒的脱氧核糖核酸(DNA)“切割”开，从而杀死病毒。

一组与限制酶有关的疑难问题分析

限制性核酸内切酶是一类在DNA分子特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的酶,简称限制酶。根据限制酶的结构,辅助因子的需求切位与作用方式,可将限制酶分为Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ三种类型。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化,又催化非甲基化的DNA的水解;Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解;Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。

限制性核酸内切酶的规范表达

限制性核酸内切酶，简称限制酶，是分子生物学操作过程中必不可少的基本工具。目前，国内科技期刊中普遍存在对限制酶的表达比较混乱且不规范的现象。关于限制酶的规范表达是有据可依的。文献[4—5]对酶的规范表达作了一些探讨，笔者在其基础上对限制酶的命名原则作了详细介绍，并调查了2011年出版的31种涉及限制酶的期刊的编排情况，给出了限制酶的规范表达形式。

限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）

利用基因重组技术的研究以及产品的制造得到广泛普及，其中的有功之臣就是限制性核酸内切酶。具有识别特定的碱基序列并加以切割的功能。日本东京大学的小宫山真教授为我们就其有关机理及应用用研究进行阐述。