核黄素光化学处理下贮存末期血小板miRNA的表达谱分析

目的分析核黄素光化学技术(VB2-PRT)处理下贮存d1和d5血小板微小RNA(miRNA)表达谱的变化,探讨贮存末期VB2-PRT处理miRNA参与调控血小板发生贮存损伤(PSL)的分子机制。方法留取无偿献血者单采血小板20人份(5 mL/份),混合摇匀,使用终浓度为50μmol/L VB2和6.24 J/mL紫外线(UV)B光照处理8 min后,均分为2等份,贮存于(22±2)℃恒温血小板振荡保存箱中,分别在d1和d5取样(5 mL),采用纳米球(DNB)测序技术对血小板miRNA组测序,采用DEGseq和MA-plot分析软件筛选2组(不同贮存期)差异表达的小RNA,当2组间的血小板miRNAs表达量差异≥2倍(P<0.01)时,采用miRanda和TargetScan软件预测靶基因及基因本体论(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析。采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测miRNA的表达以验证DNB测序结果。结果miRNA表达谱:VB2-PRT处理后贮存d5与d1血小板相比,共有590个表达量差异明显的miRNAs,其中上调255个(如miR-99b、miR-7等),下调335个(如miR-451a、miR-19b等);已知272个miRNAs中,表达上调的112个,表达下调160个;新见miRNAs序列318条。d5与d1组差异表达miRNAs靶基因呈明显富集的GO条目(term)包括细胞组分、细胞器、细胞膜等细胞成分,涉及黏附、催化、分子转换、运输、转录因子和受体活性等分子功能,涉及细胞加工、代谢、生物调节、应激等生物过程。相应的KEGG富集前10的通路中主要是分泌、糖代谢、信号转导、膜转运、翻译、环境适应等信号通路。随机挑选的6个差异表达miRNAs所做荧光定量PCR结果与测序结果均一致。结论VB2-PRT处理下贮存d5血小板miRNA表达谱较贮存d1时发生明显变化,功能预测提示这些miRNAs可能参与VB2-PRT处理下血小板发生PSL的调控。

核黄素光化学法病毒灭活对新鲜血浆活性影响的探讨

目的探讨核黄素光化学法病毒灭活对新鲜血浆活性的影响,为临床合理应用病毒灭活血浆提供理论参考依据。方法收集血液中心提供的健康献血者新鲜血浆样本100份。以核黄素光化学法对100份新鲜血浆进行病毒灭活,分别检测100份血浆样本在病毒灭活处理前后的APTT、FIB、总蛋白(Tg)和FⅧ含量。将数据进行对比分析。结果新鲜血浆在核黄素光化学法病毒灭活后与未作病毒灭活处理相比较,APTT时间延长14.93s,差异有统计学意义(P<0.05);FIB含量减少0.94 mg/m L,差异有统计学意义(P<0.05);Tg含量减少3.39 g/L,差异无统计学意义(P>0.05);FⅧ含量减少0.26 IU/m L,差异有统计学意义(P<0.05)。结论核黄素光化学法病毒灭活在灭活病毒、提高输血安全的同时导致血浆中活性成分有一定程度降低,临床上在应用灭活血浆时应注意适当增加血浆用量以提高血浆输注疗效。

核黄素光化学法诱导淋巴细胞凋亡及其机制研究

目的探讨核黄素光化学法(RF-PRT)灭活淋巴细胞的效果及潜在机制。方法汇集ABO/D淋巴细胞,分离,并用RF-PRT或UV处理或不处理。处理后,CCK-8检测经植物血凝素刺激下淋巴细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期或细胞凋亡。蛋白质印迹测定GADD45α,p38和c-Jun N端激酶(JNK)蛋白表达水平的变化。评估GADD45α,p38和JNK对细胞凋亡的影响。结果 RF-PRT显著抑制淋巴细胞增殖和G1阻滞。与UV组或对照组比较,RF-PRT组淋巴细胞凋亡率显著增加,RF-PRT对淋巴细胞的灭活作用与GADD45α表达上调,激活p38和JNK信号通路有关。而siGADD45α抵消了RF-PRT的作用。结论 RF-PRT通过促进GADD45α表达,激活p38和JNK信号通路抑制淋巴细胞增殖并诱导凋亡。

荧光定量PCR法评价核黄素光化学法灭活全血病毒的效果

目的 了解荧光定量PCR法（qPCR）评价核黄素光化学法灭活含疱疹病毒8型（HHV-8）全血的效果。方法 在常规检测合格的全血中,分别加入含105、106、107 copy/mL HHV-8的淋巴细胞BC-3和核黄素,以40-160J/mLRBC的紫外光辐照进行病毒灭活。以HHV-8ORF26为中心设计4对PCR套式扩增引物（产物长度为2 998、1 252、561、206bp）,构建和优化PCR预扩增条件,以qPCR检测灭活前、后4个片段在不同辐照条件下的扩增产物经梯度稀释的Ct值,计算相应的病毒滴度ΔLog值,以评估对病毒核酸的损伤情况。结果 核黄素光化学法对全血中HHV-8核酸有损伤作用,PCR预扩增HV-1（2 998bp）片段可用于评估辐照后HHV-8的病毒核酸损伤情况。病毒滴度ΔLog值随着病毒滴度、辐照强度和扩增片段长度的增加,最高达1.9Log值。结论 在HHV-8高流行区缺乏常规血液筛查HHV-8方法情况下,可采用核黄素光化学法进行体外灭活,降低其传播的可能性。

核黄素光化学法对人外周血淋巴细胞灭活作用的研究

目的研究核黄素光化学法对人外周血淋巴细胞的增殖及细胞因子分泌活性的抑制作用,探讨该方法对淋巴细胞凋亡的诱导作用。方法实验分为实验组:从随机采集的全血中分离淋巴细胞,将其悬浮于核黄素终浓度为100μM的自体血浆中,注入PVC袋,在波长为420 nm的可见光下照射,总照射剂量为40 J/cm2;对照组:使用相同来源的淋巴细胞,悬浮于不含核黄素的自体血浆中,不进行光照处理。用植物凝集素(PHA)同步刺激两组淋巴细胞,用BrdU细胞增殖检测试剂盒检测淋巴细胞的增殖活性,并计算核黄素光化学法对淋巴细胞的增殖抑制率;用酶联免疫试剂盒检测淋巴细胞细胞因子的分泌量;使用Annexin V-PE细胞凋亡试剂盒和流式细胞技术检测细胞凋亡。结果与对照组比较,经过核黄素光化学法处理的实验组淋巴细胞对PHA刺激的增殖抑制率为(94.69±7.61)%;实验组淋巴细胞接受PHA刺激后,细胞因子IFN-γ、IL-10和IL-12的分泌量与对照组比较分别降低了(89.54±22.75)%、(77.83±22.3)%和(88.57±15)%,IL-4的分泌量较对照组差异不明显;流式细胞术检测结果表明,实验组绝大多数淋巴细胞发生了凋亡,其早期凋亡率和晚期凋亡或坏死率均明显高于对照组。结论核黄素光化学法能够抑制人外周血淋巴细胞的增殖和一些细胞因子的分泌,同时可诱导淋巴细胞凋亡。该方法有望成为预防TA-GvHD的新途径。

不同保护剂对313nm激发光下核黄素光化学法细菌灭活能力的影响

目的研究313nm激发光下核黄素光化学法对细菌的灭活作用,探究灭活处理过程中不同保护剂以及盛装材料对灭活效果的影响。方法在核黄素光化学细菌灭活处理过程中加入不同浓度的血液成分保护剂:甘露醇、维生素C、色氨酸、组氨酸,探讨它们对细菌灭活效果的影响;通过细胞培养板与PVC血袋2种盛装材料探讨不同器具对细菌灭活效果的影响。结果在313nm光源激发下,核黄素光化学作用能使血袋中大肠杆菌及表皮葡萄球菌下降3 log/mL。所有保护剂对大肠杆菌和表皮葡萄球菌的灭活效果均无显著影响。液层厚度对灭活效果有重要影响。结论各保护剂对细菌灭活无不良影响,可用于进一步血液成分功能的保护研究。

核黄素光化学处理与未处理后不同贮存时间血小板miRNA表达谱的差异分析

目的分析核黄素光化学技术(VB_(2)-PRT)处理与否的贮存d1和d5血小板微小RNA(miRNA)表达谱的变化,探讨VB_(2)-PRT处理miRNA参与调控血小板发生贮存损伤(PSL)的分子机制。方法留取无偿献血者单采血小板20(人)份(5 mL/份),混合摇匀后均分为2等份,1份为VB_(2)-PRT处理组(E组):使用终浓度为50μmol/L VB_(2)和6.24 J/mL紫外线(UV)B光处理8 min;另1份为对照组(C组):不做处理;2组皆贮存于(22±2)℃恒温血小板振荡保存箱中。在贮存d1和d5分别取样(5 mL),分别命名为E1、E5、C1和C5组,采用纳米球(DNB)测序技术对其做血小板miRNA组测序,采用DEGseq和MA-plot分析软件筛选E和C组间差异表达的小RNA,当E和C组间的血小板miRNAs表达差异≥2倍(P<0.01)时,对这部分血小板miRNA做靶基因预测及GO功能富集和KEGG信号通路富集分析。结果E1和C1组血小板miRNA的表达谱相比:在E1组中筛选出487个表达差异明显(P<0.01)的miRNAs,包括220个miRNAs表达上调,如miR-146a和let-7b等,267个表达下调,如miR-7和miR-1260等;E5和C5组血小板miRNA的表达谱相比:在E5中筛选出229个表达差异明显(P<0.01)的miRNAs,包括80个miRNAs表达上调,如miR-423和miR-378等,149个表达下调,如miR-451和miR-30等。E1与C1组以及E5与C5组的差异表达miRNAs靶基因呈明显富集的GO条目(term)数相似,包括细胞组分、细胞器、细胞膜等细胞结构,黏附、催化、分子转换、运输、转录因子和受体活性等分子功能,细胞加工、代谢、生物调节、应激等生物过程。E5与C5组相应的KEGG富集前10的通路中,较E1与C1组不同的是缺少涉及环境适应、翻译和黏蛋白合成信号通路,却增加了肌醇磷酸代谢、磷脂酰肌醇信号系统和趋化因子信号通路。结论经VB_(2)-PRT处理的血小板贮存一段时间其miRNAs表达谱发生明显变化;功能预测提示这些miRNA可能参与VB_(2)-PRT处理下血小板发生PSL的调控。

核黄素光化学法对红细胞形态及细胞膜影响的实验研究

目的研究420 nm可见光下核黄素光化学法对红细胞功能的影响。方法从ACD全血中分离得到红细胞,按比例重悬于红细胞保存液中。实验组加入终浓度100μmol/L的核黄素,取5 m L注入PVC袋,置420 nm可见光光源下照射,照射剂量40 J/m L。对照组不加核黄素,取5 m L注入PVC袋,不光照。2组均在(4±2)℃储存,于保存0、7、14、21、28、35、42 d测定实验组与对照组的渗透脆性、红细胞数量、Hct、平均红细胞体积,储存0、14、28、42 d检测游离Hb含量、溶血率。结果可见光下核黄素光化学处理:实验组与对照组红细胞均在Na Cl溶液浓度为0.48%时开始溶血;储存期末实验组红细胞数量为(5.61±0.28)×1012/L、对照组(5.52±0.52)×1012/L(P>0.05);储存期末红细胞Hct实验组为(54±2)%、对照组为(53±4)%(P>0.05);储存期末实验组平均红细胞体积(96.50±2.48)f L、对照组(96.76±2.86)f L(P>0.05);储存期末FHb实验组为(0.137±0.005)g/L,高于对照组(0.081±0.005)g/L(P<0.05);储存期末红细胞溶血率实验组(0.039±0.004)%,高于对照组(0.020±0.005)%(P<0.05),但仍满足标准。结论用420 nm可见光为照射光源,核黄素光化学法对红细胞的形态和膜结构无明显影响。

利用动物模型评价核黄素光化学法灭活红细胞病毒的效果

本研究旨在评估核黄素光化学法(核黄素终浓度为150μmol/L,光照时间为20分钟,光照强度为40 000Lux)灭活红细胞中病毒的有效性。将HCMV作为指示病毒加入红细胞中。30只BALA/c小鼠设为实验组(n=10)、病毒对照组(n=10)、可见光对照组(n=5)和红细胞对照组(n=5);实验组小鼠注射经核黄素光化学法灭活处理的红细胞;病毒对照组小鼠注射未经灭活处理的红细胞;可见光对照组小鼠注射经可见光照射的红细胞;红细胞对照组小鼠注射正常红细胞。取各组小鼠进行体外病毒分离,PCR检测HCMV UL83基因,间接免疫荧光鉴定PP65抗原。结果表明:病毒对照组和可见光对照组病毒分离、PCR及间接免疫荧光检测均为阳性,而实验组和红细胞对照组所有结果均为阴性。结论:核黄素光化学法灭活红细胞病毒是有效的。

核黄素光化学法处理对全血中淋巴细胞功能的影响

目的 研究核黄素光化学法在一定剂量条件下处理全血后对全血中淋巴细胞功能的影响。方法 随机选取多人份当天采集的全血,实验组全血中加入核黄素溶液,终浓度160 μmol/mL,并注入光照血袋中,全血厚度约1.3 mm,放置灭活仪中接受18 J/cm^2的紫外照射剂量;对照组使用相同来源的全血,不加核黄素不进行紫外照射。分离提取全血中淋巴细胞,用CCK-8试剂盒检测淋巴细胞增殖活性,计算其增殖抑制率;用终浓度为1 μg/mL的植物血凝素(PHA)同步刺激两组淋巴细胞后,检测其细胞因子的分泌量。结果 核黄素光化学法处理后,淋巴细胞增殖抑制率为(74.18±14.00)%;未经PHA刺激,淋巴细胞中IFN-γ、IL-8、IL-12、IL-10、IL-13、IL-4细胞因子分泌量分别下降了63%、35%、61%、42%、77%、8%;加PHA刺激后,淋巴细胞中IFN-γ、IL-8、IL-12、IL-10、IL-13、IL-4细胞因子分泌量分别下降了72%、43%、40%、78%、82%、2%;两组IL-4的分泌量无统计学差异。结论 核黄素光化学法在一定的剂量条件下处理全血,会抑制全血中淋巴细胞的增殖功能和细胞因子分泌功能,但并没有完全丧失,仍可保持一定的功能活性,对未来利用核黄素光化学法建立血液体外循环处理回输技术有一定的参考意义。

核黄素和紫外线光化学法处理血浆制品中中东呼吸综合征冠状病毒的灭活效果观察

中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）被认为是对血液制品安全性有潜在危害的一种病毒。核黄素和紫外线光化学法能够灭活血液相关病原体，使之失去传染性，且不会破坏血液制品的质量。本研究报道核黄素和紫外线光化学法对人类血浆中MERS-CoV病毒的灭活效果。

复方生脉饮及四物汤消除超氧阴离子的作用

目的 研究生脉饮、四物汤及各单味药消除超氧阴离子的作用。方法 核黄素光化学氧化 偶氮显色分光光度法测定消除超氧阴离子的作用 ,正交实验确定消除超氧阴离子作用最佳的配方。结果 人参、麦冬、五味子的配方为 1∶1∶3时生脉饮的作用最强 ,五味子的影响最大。熟地黄、川芎、当归、白芍的配方为 2∶3∶2∶3时四物汤的作用最强 ,白芍、川芎的影响最大。结论 生脉饮。

常见蔬菜消除超氧阴离子作用的研究

用核黄素光化学氧化光度法研究了南瓜、玉米、大蒜、苦瓜、空心菜、西红柿、胡萝卜、韭菜花 8种常见蔬菜对超氧阴离子的消除作用。结果表明这些蔬菜均具有消除超氧阴离子的作用 ;煮沸 2 0min ,玉米和南瓜的消除超氧阴离子能力减弱约 30 % ,空心菜的有所上升 ,而大蒜、苦瓜、西红柿、胡萝卜、韭菜花的消除作用均没有变化。将吸光度随这八种蔬菜提取液加入量的变化趋势与维生素C的相比较 。