新型生物陶瓷材料对人根尖牙乳头干细胞增殖及成骨分化的影响

目的评估新型生物陶瓷类材料c-Root SP对人根尖牙乳头干细胞(hSCAPs)的细胞增殖及骨诱导能力。方法制备不同浓度c-Root SP浸提液,采用CCK-8法检测其对hSCAPs的细胞增殖情况,使用碱性磷酸酶(ALP)活性测定法测定ALP酶水平和茜素红染色法观察钙化结节形成情况,数据采用单因素方差分析,与iRootSP对比,评价c-Root SP促进细胞增殖及骨诱导能力。结果c-Root SP对hSCAPs的细胞增殖具有浓度依赖性,1/10浓度浸提液增殖水平最好,c-Root SP1/5、1/10、1/1000浓度浸提液对hSCAPs的细胞增殖的影响显著高于同浓度iRoot SP浸提液(P<0.05)。成骨方面,矿化诱导7天,iRoot SP ALP活性显著高于c-Root SP(P<0.05),矿化诱导14天c-Root SP矿化结节显著多于iRoot SP。结论c-Root SP具有对hSCAPs的良好细胞增殖及骨诱导能力,与iRoot SP相似。

根尖牙乳头干细胞外泌体通过AHR调节CDC42转录促进血管内皮细胞迁移的机制研究

目的:探究根尖牙乳头干细胞来源的外泌体(SCAP-Exo)调控细胞分裂周期蛋白42(CDC42)转录介导血管内皮细胞(VECs)迁移的分子机制。方法:超速离心法提取SCAP-Exo并应用透射电镜和纳米粒子追踪实验鉴定。构建CDC42低表达的VECs,应用SCAP-Exo处理VECs,实时荧光定量PCR与Western blot实验检测SCAP-Exo处理后CDC42的基因和蛋白表达水平,通过划痕实验和Transwell迁移实验检测VECs迁移能力。通过Western blot和免疫荧光染色实验,检测SCAP-Exo对VECs中芳香烃受体(AHR)核转位以及CDC42表达的影响。结果:SCAP-Exo可以上调CDC42基因和蛋白表达水平,增强VECs的迁移能力。与SCAP-Exo处理的正常VECs相比,VECs低表达CDC42后加入SCAP-Exo,迁移能力明显降低。SCAP-Exo可以促进VECs内AHR转位至细胞核内,当抑制VECs中AHR核转位后,VECs内CDC42的基因和蛋白表达水平下降。结论:SCAP-Exo通过激活VECs内AHR入核促进CDC42转录,进而上调CDC42的蛋白表达水平,从而增强VECs的迁移能力。

根尖牙乳头干细胞来源凋亡囊泡对巨噬细胞糖酵解相关酶的表达及炎症表型影响的初探研究

目的:探究根尖牙乳头干细胞(SCAP)来源的凋亡囊泡(apoVs)是否通过影响糖酵解相关酶调控巨噬细胞(BMDMs)炎症表型,进而对炎症反应产生调节作用。方法:体外培养鉴定人源SCAP,经星形孢菌素诱导凋亡后提取apoVs,利用扫描电镜、流式细胞术等对其进行表征鉴定。分别空白处理、脂多糖(LPS)处理、LPS同apoVs共处理大鼠骨髓来源的BMDMs,利用流式细胞术检测促炎表型BMDMs表面标志分子CD80、CD86的表达,利用Western blot检测BMDMs糖酵解相关酶的表达。结果:根尖牙乳头干细胞来源的apoVs能被BMDMs摄取,促炎表型标志分子CD80、CD86的表达下调,糖酵解相关酶葡萄糖转运蛋白(GLUT)1、GLUT3的表达显著下调(P<0.05)。结论:SCAP来源apoVs能降低促炎型BMDMs的分布,并对其糖酵解相关酶的表达产生影响。

消退素E1对炎症微环境下根尖牙乳头细胞的影响

目的 探讨消退素E1(resolvin E1,RvE1)对脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导的炎症微环境下根尖牙乳头细胞(apical papilla cells, APCs)成牙本质方向分化及细胞自噬的影响。方法 将人APCs分为对照组、LPS组和LPS RvE1组,应用MTT检测细胞增殖情况,应用realtime-PCR检测成牙本质方向分化相关基因表达情况,应用茜素红染色及氯化十六烷基吡啶半定量分析检测APCs矿化结节形成情况,应用Western blot检测APCs自噬相关蛋白表达情况。结果 与对照组比较,LPS组的APCs增殖受到抑制,成牙本质方向分化及矿化结节形成减弱,细胞自噬增强(P<0.05)。与LPS组比较,LPS RvE1组的APCs增殖、成牙本质方向分化及矿化结节形成均增强,细胞自噬减弱(P<0.05)。结论 RvE1促进炎症微环境下APCs成牙本质方向分化和降低自噬。

WDR63促进人根尖牙乳头干细胞成神经分化功能

目的:研究WD重复结构域63(WDR63)对人根尖牙乳头干细胞(SCAPs)体外成神经分化能力的作用。方法:通过实时荧光定量PCR检测未转染慢病毒SCAPs中WDR63基因在成神经分化诱导3、6、9 d的表达变化,利用慢病毒转染分别获得WDR63稳定过表达和敲低的SCAPs,通过类神经球形成实验对各组SCAPs进行神经分化诱导,对类神经球的直径进行定量分析,免疫荧光染色实验检测SCAPs中巢蛋白(Nestin)和βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)的表达,实时荧光定量PCR实验检测神经分化相关指标βⅢ-tubulin、神经源性分化蛋白(NeuroD)、神经细胞黏附分子(NCAM)和Nestin基因的表达。结果:未转染慢病毒SCAPs中WDR63的表达量在成神经分化后的3、6、9 d逐渐增加(P<0.05);过表达WDR63后,WDR63基因(P<0.001)和蛋白表达增加,神经球直径增加(P<0.01),Nestin和βⅢ-tubulin神经球样细胞荧光强度增加(P<0.01),βⅢ-tubulin、NeuroD、NCAM和Nestin基因表达升高(P<0.05);敲低WDR63后,WDR63基因(P<0.01)和蛋白的表达降低,神经球直径降低(P<0.05),Nestin和βⅢ-tubulin神经球样细胞荧光强度减少(P<0.05),βⅢ-tubulin、NeuroD、NCAM和Nestin基因表达降低(P<0.05)。结论:WDR63可促进SCAPs的成神经分化功能。

根尖牙乳头干细胞成骨分化的研究进展

根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)具有很强的多系分化潜能,其中成骨分化可以应用于骨组织再生,为口腔颌骨缺损治疗提供新思路。成骨分化是个复杂的网络调控过程,诸如各种细胞因子、表观遗传物质、各种信号分子和信号通路等内源性物质均可产生不同程度的影响。这些因素相互作用可以促进SCAP的增殖、迁移和成骨分化,但其在SCAP成骨分化的不同进程中的具体机制和内在联系各不相同。对近年来有关促进SCAP成骨分化的各种因素及其可能的调控机制研究文献进行综述,以期为其进一步的应用研究提供新信息。

IL-34介导的NF-кB信号通路对根尖牙乳头干细胞成牙成骨定向分化的调节作用

目的:探讨白细胞介素-34(IL-34)介导的核因子кB(NF-кB)对根尖牙乳头干细胞(SCAPs)成牙/成骨定向分化调节作用。方法:使用酶消化法从小鼠根尖牙乳头组织传代培养SCAPs;流式细胞术鉴定SCAPs中CD44、CD90、CD45及集落刺激因子1受体(CSF-1R)的表达;实验分为4组:空白对照组、IL-34组(100 ng/mL IL-34)、CSF-1R组(100 ng/mL IL-34+25 ng/mL anti-CSF-1R)、NF-кB组(100 ng/mL IL-34+1umol/L BMS-345541)。通过蛋白质印迹法(Western blot)分析各组30、60、120 min时SCAPs胞浆中NF-кB关键蛋白p-IкBα、IкBα、p-P65及P65蛋白的表达情况;矿化诱导4组SCAPs 3、7、14 d时,茜素红染色和半定量分析比较各组细胞的矿化结节形成能力;通过RT-qPCR检测各组SCAPs中成骨相关基因Runt相关转录因子-2(RUNX2)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨钙素(OCN)mRNA水平。结果:流式细胞术显示,SCAPs中CD44(90.4%)、CD90(93.5%)阳性表达,造血干细胞CD45(3.1%)阴性表达,SCAPs表达CSF-1R(23.2%)阳性。与对照组比较,IL-34组SCAPs胞浆蛋白内p-IкBα、p-P65表达水平上调,矿化诱导3、7、14 d矿化结节形成量增多,细胞中RUNX2、DSPP、OCN mRNA相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与IL-34组比较,CSF-1R组和NF-кB组SCAPs胞浆蛋白内p-IкBα、p-P65表达水平下调(P<0.05),矿化诱导3、7、14 d矿化结节形成量减少,细胞中RUNX2、DSPP、OCN mRNA相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:IL-34可通过IL-34/CSF-1R调节SCAPs中NF-кB信号通路,并通过IL-34/CSF-1R/NF-кB信号调节SCAPs的成牙/成骨定向分化能力。

犬根尖牙乳头干细胞的分离培养和生物学特性

目的:分离培养比格犬(Beagle犬)根尖牙乳头干细胞并研究其生物学特性。方法:拔除Beagle犬上颌年轻恒前牙,切取根尖牙乳头,采用酶消化法分离培养Beagle犬根尖牙乳头细胞,进行成纤维细胞克隆形成实验、生长曲线测定、多向分化能力研究及间充质干细胞相关表面标记物STRO-1、CD146和CK的表达分析,并将其移植至免疫缺陷鼠皮下观察矿化组织的形成。结果:Beagle犬根尖牙乳头组织中存在一群具有高度增殖能力的细胞,在相同培养条件下,其克隆形成率明显高于人根尖牙乳头干细胞,差异具有统计学意义(P<0.001);所获得Beagle犬根尖牙乳头干细胞具有成骨、成脂和成软骨等多向分化能力;在体外经成骨诱导后可形成矿化结节,成脂诱导后可形成脂滴,成软骨诱导后免疫组织化学染色Ⅱ型胶原阳性表达;同时该群细胞STRO-1和CD146阳性表达,而CK阴性表达;与羟基磷灰石混合移植于免疫缺陷鼠皮下可形成矿化组织和牙髓-牙本质复合体样结构。结论:Beagle犬根尖牙乳头中存在具有高增殖能力和多向分化能力的根尖牙乳头干细胞。

TGF-β1对人根尖牙乳头干细胞增殖和分化的影响

目的:研究转化生长因子(TGF-β1)在体外对根尖牙乳头干细胞(SCAP)增殖和分化的影响。方法:采用酶消化法获得原代培养人SCAP,并对获得克隆化的SCAP进行免疫组化染色和多向分化能力的初步鉴定。用MTT比色法观察不同浓度的TGF-β1对细胞增殖情况,并通过检测ALP活性和矿化诱导后COL1、DSPP、OCN mRNA表达,分析TGF-β1对SCAP分化能力的影响。结果:5、10、20、40 ng/mL组的TGF-β1在SCAP培养1周内可显著促进细胞增殖(P<0.05);在TGF-β1作用8 d后,细胞ALP活性增强(P<0.05);SCAP矿化诱导2周后,TGF-β1组中COL1、OCN、DSPP的mRNA表达上调(P<0.05)。结论:TGF-β1促进SCAP细胞增殖,并通过提高ALP活性和上调COL1,OCN、DSPP mRNA的表达促进SCAP分化。

根尖牙乳头干细胞细胞膜片构建及其成骨/成牙本质分化性能研究

目的:构建根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)细胞膜片,并对其组织学形态和成骨/成牙本质分化性能进行研究,为SCAP细胞膜片应用于年轻恒牙牙髓再生提供实验基础。方法:分离年轻恒牙第三磨牙牙乳头,进行SCAP原代培养。采用流式细胞术检测SCAP表面标志物,茜素红S染色检测其成骨/成牙本质分化。取第3代SCAP,膜片诱导液连续培养14d,形成细胞膜片。对SCAP细胞膜片进行H-E染色,组织学观察;流式细胞术检测SCAP细胞膜片的细胞周期变化;实时定量PCR(qRT-PCR)检测细胞膜片中Runx2、ALP、Col-I基因表达;Western印迹法检测细胞膜片Runx2、ALP蛋白表达水平。采用SPSS17.0软件包对实验结果进行统计学分析,两样本细胞周期检测和q RT-PCR基因检测均数的比较采用t检验。结果:组织学H-E染色显示,SCAP细胞膜片由5~6层细胞组成,细胞量大,细胞之间排列紧密,且富含细胞外基质。SCAP细胞膜片细胞周期G2+S期所占比例较低,而G1期比例较高,提示SCAP细胞膜片增殖性能受到显著抑制(P<0.05)。同时,qRT-PCR和Western印迹法结果显示,与SCAP相比,SCAP细胞膜片成骨/成牙本质分化能力显著升高(P<0.05)。结论:SCAP细胞膜片富含细胞外基质,且成骨/成牙本质分化能力高于单纯SCAP,SCAP细胞膜片应用于牙髓再生更具有优势。

血小板裂解液对人根尖牙乳头干细胞和牙周膜干细胞体内外增殖、矿化能力的影响

目的:研究血小板裂解液(Platelet Lysate,PL)在体内外对人根尖牙乳头干细胞(SCAP)和牙周膜干细胞(PDLSCs)增殖、矿化的干预效应,以期找到PL应用于这两种细胞的最佳方式。方法:在矿化诱导培养体系中按一定体积比加入PL,分别作用于体内、外复合HA-TCP支架材料三维生长的SCAP和PDLSCs,扫描电镜(SEM)以及组织学观察细胞生长、分化情况。结果:体外三维培养模式下,PL能够促进SCAP和PDLSCs的增殖以及矿化细胞外基质的形成,并利于在支架材料上形成完整的细胞膜片(cell sheet)样结构,以上效应对于PDLSCs作用更为显著。而在体内移植模式下,经50 mL/L、10 mL/L PL培养体系预培养的SCAP能形成包含成牙本质细胞样细胞、牙本质样基质和牙髓组织的牙本质牙髓复合体样结构;而PDLSCs经50 mL/LPL干预后,可分化为成牙骨质细胞样细胞,并生成牙骨质样基质、牙周膜样组织。结论:一定体积浓度比的PL能促进SCAP和PDLSCs在体内外的增殖以及成骨、成牙本质分化。

bFGF对人根尖牙乳头干细胞成脂分化影响的研究

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在体外对人根尖牙乳头干细胞(stem cellsfrom apical papilla,SCAP)成脂分化的影响。方法:采用酶消化法获得原代SCAP,用含有5 ng/mL bFGF的成脂诱导液对其诱导培养不同时间,显微镜观察细胞形态变化、油红0染色观察SCAP成脂分化能力、RT-PCR检测PPAR-γ2 mRNA表达情况。结果:SCAP在含有5 ng/mL bFGF成脂诱导液中培养3周,细胞中脂滴形成数量多于对照组,而且细胞密度也相对较大,细胞体积小,未见拉长、变大等现象。RT-PCR检测显示,诱导培养1周时,实验组与对照组PPAR-γ2 mRNA表达无显著性差异(P>0.05);培养3周时,实验组PPAR-γ2 mRNA表达量明显高于对照组(P<0.05)。结论:bFGF具有促进SCAP成脂分化的潜能。

肝细胞生长因子对根尖牙乳头干细胞增殖和矿化能力的影响

目的:探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对体外培养的根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical pa-pilla,SCAP)增殖和矿化能力的影响。方法:将SCAP细胞分别在标准培养液、含有10ng/ml HGF的培养液以及矿化诱导培养液中培养,分为空白对照组、HGF组、矿化诱导组和HGF+矿化诱导组。通过MTT法、碱性磷酸酶(alkaline phosphotase,ALP)活性检测、茜素红染色和氯代十六烷基吡啶定量检测SCAP细胞增殖和矿化能力的改变。结果:MTT结果显示,HGF可以促进矿化诱导下的SCAP细胞的增殖能力(P<0.005)。与其他组相比较,HGF+矿化诱导组SCAP细胞的ALP活性明显上调,矿化能力显著提高(P<0.005)。结论:10ng/ml HGF可明显促进SCAP细胞的增殖和矿化能力。

人根尖牙乳头细胞分离、培养的研究

目的:探讨采用组织块法从根尖牙乳头中分离AP细胞,为牙体及牙髓再生研究奠定基础。方法:前磨牙根尖分离牙乳头;组织块法分离AP细胞,计算集落形成率;免疫荧光、流式细胞仪检测细胞标记物。结果:细胞集落形成率为10～20colonies/103细胞;细胞贴壁生长梭形或多角形核浆比大;原代细胞生长慢,传代后细胞生长快,可传12代以上;细胞表达间质干细胞标记物,AP细胞还表达神经干细胞标记物CD24、Nestin;不表达DSP。结论:组织块法能有效分离牙乳头细胞,AP细胞不同于牙髓干细胞(CD24-)。

NFκB信号通路在炎症根尖牙乳头干细胞中的作用

目的研究NFκB信号通路在炎症条件下对根尖牙乳头干细胞的作用。方法利用TNFα和Ecoli.LPS刺激人根尖牙乳头干细胞。Western Blot检测IκBα的磷酸化及蛋白降解,采用Real-time PCR在mRNA水平检测IL6及IL8的表达。结果 10 ng/ml TNFα或500ng/ml Ecoli.LPS能诱导IκBα磷酸化及蛋白降解,并且促进NFκB的下游基因IL6及IL8的表达。结论在炎症根尖牙乳头干细胞,TNFα或LPS可以通过IκK复合体激活NFκB信号通路。NFκB信号通路的活化可能是导致炎症状态下根尖牙乳头干细胞功能损害的重要因素。

组蛋白去甲基化酶KDM4B促进根尖牙乳头干细胞中成骨和成牙本质分化

目的研究组蛋白去甲基化酶KDM4B对根尖牙乳头干细胞定向分化能力的影响。方法人重组骨形成蛋白4(BMP4)刺激根尖牙乳头干细胞后检测KDM4B的表达;利用慢病毒转染过表达或者基因敲除KDM4B进行获得性或丧失性功能研究。通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色、钙离子定量分析研究根尖牙乳头干细胞体外成骨和成牙本质分化能力。结果 BMP4促进根尖牙乳头干细胞KDM4B的表达。基因敲除KDM4B抑制根尖牙乳头干细胞ALP活性及体外矿化能力、促进转录因子PPAR-gamma的表达。过表达KDM4B增强根尖牙乳头干细胞ALP活性和体外矿化能力。结论组蛋白去甲基化酶KDM4B具有促进根尖牙乳头干细胞成骨和成牙本质分化的潜能。

HOXC6同型蛋白2对根尖牙乳头干细胞成骨/成牙分化功能的影响

目的探讨同源盒基因C6同型蛋白2对牙源性间充质细胞成骨/成牙分化的影响。方法成骨诱导培养基诱导人根尖牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化;逆转录病毒转染构建过表达HOXC6-ISO2稳定转染牙乳头干细胞进行HOXC6-ISO2获得性功能研究;碱性磷酸酶活性实验检测成骨/成牙早期分化指标-碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR检测成骨/成牙分化相关基因-Sp7转录因子、Runt相关转录因子2和骨钙素及同源盒基因C6下游基因胰岛素结合蛋白5的表达。结果结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞的碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR显示过表达同源盒基因C6同型蛋白明显抑制骨钙素的表达,并且抑制下游基因胰岛素结合蛋白5的表达。结论同源盒基因C6同型蛋白2通过抑制下游基因胰岛素结合蛋白5抑制牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化的功能。

17β-雌二醇对人根尖牙乳头干细胞RANKL、OPG表达影响的研究

目的:探讨17β-雌二醇对人根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAPs)核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的影响。方法:通过酶消化法分离培养SCAPs,将SCAPs分别于对照组(普通培养基+10μmol/L无水乙醇)和含0.1μmol/L17β-雌二醇的培养基培养3d和7d后,实时荧光定量PCR法和蛋白质免疫印迹法分别检测RANKL、OPG mRNA和蛋白表达。结果:17β-雌二醇刺激3d和7d组,OPGmRNA和蛋白表达均较对照组升高(P<0.01),RANKL mRNA和蛋白表达均较对照组降低(P<0.01)。结论:17β-雌二醇可能通过调节RANKL/OPG系统,参与调节SCAPs成牙/骨及破牙/骨活性。

干细胞因子对根尖牙乳头干细胞迁移的影响

目的研究不同浓度干细胞因子(SCF)对于根尖牙乳头干细胞(SCAPs)迁移的作用。方法采用Transwell迁移实验、免疫荧光染色和激光共聚焦显微系统等方法,研究不同浓度SCF对SCAPs迁移的作用。结果 SCF对SCAPs的迁移有促进作用,浓度低于100 ng/ml时,促进作用随着浓度的增高而增强,浓度超过100 ng/ml后,促进作用随着浓度的增高而呈下降趋势,在100 ng/ml时促进作用最强。结论 SCF能够促进SCAPs的迁移作用,可以作为趋化因子应用于今后牙髓再生的研究中。

过表达BCOR基因抑制根尖牙乳头干细胞成肌分化

目的:研究B细胞淋巴瘤因子6共抑制因子(BCL6co-repressor,BCOR)对根尖牙乳头干细胞成肌分化能力的影响。方法:利用HA-BCOR逆转录病毒载体过表达BCOR进行获得性功能研究;Western Blot检测HA-BCOR的过表达效果;重组人肿瘤生长因子β1(TGF-β1)蛋白诱导根尖牙乳头干细胞体外成肌分化;通过检测成肌分化相关基因smoothened(SMO)、smooth muscle actin alpha2(ACTA2)和caldeson(CALD1)的表达研究根尖牙乳头干细胞体外成肌分化能力。结果:Western Blot结果显示HA-BCOR可以在根尖牙乳头干细胞有效的过表达;过表达BCOR抑制根尖牙乳头干细胞成肌分化相关基因SMO和CALD1的表达。结论:过表达BCOR基因抑制根尖牙乳头干细胞体外成肌分化,证实BCOR是根尖牙乳头干细胞成肌分化的抑制基因。