杨梅根瘤Frankia菌分离株的遗传多样性研究

对分离自杨梅根瘤的10株Frankia菌分离株进行表型特性研究,并用特异引物扩增其16SrD-NA,对扩增产物用2种限制性内切酶Hinf 和Hae 进行酶切后,分析酶切图谱.结果表明:这10株Frankia菌分离株不仅表型存在差异,而且其酶切图谱差异较大,说明其基因型也有差异.即使从同一株荸荠种杨梅根瘤中,不同时间分离获得的Frankia菌分离株,表型和基因型也存在较大的差异,可能属于不同的基因种群.无论是从菌株表型分析,还是PCR产物的RFLP分析,都表明从杨梅根瘤中分离获得的Frankia菌分离株存在着丰富的遗传多样性.

杨梅根瘤Frankia菌的分离和培养特性研究

从荸荠种杨梅根瘤中分离获得3个内生菌株,经显微镜检查、回接、固氮活性测定、革兰氏染色检测,证实这3个内生菌为3个Frankiasp.,分别命名为Mpc11、Mpc12、Mpa11,并对这3个分离株的培养特性进行了研究。结果表明,Mpc11、Mpc12、Mpa113个菌株的固氮酶活性分别为691nmol乙烯/mg蛋白.h、689nmol乙烯/mg蛋白.h和1039nmol乙烯/mg蛋白.h。适宜于在BAP(有氮)固体培养基、BM+NZ和FMS液体培养基上生长。且分别以葡萄糖、丙酮酸钠(含量均为1g/L)、吐温-20(含量为1mL/L)为唯一碳源或分别以酪蛋白水解物、酵母抽提物(含量均为0.5g/L)为唯一氮源的BAP培养基上生长良好;能利用丙酸钠,但利用率低;且均不能利用尿素。Mpc11和Mpa11分离株适宜于在pH5.5～6.5范围内生长,pH7.0以上则菌体生长受到抑制。

杨梅根瘤Frankia菌对重金属的抗性

采用生长抑制分析法研究从杨梅根瘤分离的10个Frankia菌菌株对9种重金属元素的抗性。一般所有供试菌株对Hg2+和Ag+敏感,大部分菌株对Pb2+(5～10mmol/L)、Cr2O72-(5～10mmol/L)、AsO2-(5～10mmol/L)不敏感,部分菌株对Cu2+、Co2+、Ni2+和Cd2+也不敏感(MICs≥0.5mmol/L,有的菌株达到5mmol/L)。菌株之间对各种重金属的抗性存在较大差异,其中菌株Mda21对所有供试重金属都敏感,而菌株Mpa11几乎能抗所有供试重金属,且有几个菌株能同时抗多种重金属。低浓度铅能促进抗铅菌株的生长,而高浓度铅对其生长有一定的抑制;抗铅菌株在含铅的培养基中仍具有固氮酶活性,在一定浓度范围内,随铅离子浓度的升高,固氮酶活性有所增强。Frankia菌的抗铅机理可能是其具有结合或螯合铅离子作用,对其他重金属的抗性机制尚不清楚。

ARDRA对植物根瘤内共生放线菌Frankia多样性的研究

应用原核生物 16SrDNA特异性引物rD1和fD1,通过ARDRA (amplifiedribosomalDNArestrictionanalysis)法直接扩增自中国云南、东北地区赤杨属 3种植物和沙棘属 1种植物根瘤内FrankiaDNA ,得到一长约 15 0 0bp的扩增产物 .选用两种内切酶HaeⅢ、AfaⅠ联合对扩增产物进行酶切 ,得到稳定的酶切图谱 .将所测48个感染赤杨的Frankia样本区分为 3个不同的组 ,所测 43个感染沙棘的Frankia样本区分为 3个不同的组 .显示根瘤内Frankia存在丰富的遗传多样性 .

沙棘属植物结瘤特性及Frankia根瘤菌分离

以4种沙棘属植物为材料,调查其在不同生境、不同季节的结瘤特点,研究弗兰克氏根瘤菌(Frankia)的特性。研究发现,同种沙棘在不同生境和同种生境不同季节,不同种的沙棘属植物在不同生境,以及同一生境不同季节的根瘤大小、形状、着生部位、颜色和结瘤率不同;植物分布海拔越高,瘤块和瘤瓣越小;4种沙棘中藏沙棘根瘤瘤瓣最大。根瘤经切片法分离培养后,从不同生境不同季节生长的4种沙棘属植物中共得到纯培养菌株53株,不同宿主中的Frankia根瘤菌种类不同,同一宿主中也存在不同种类的Frankia根瘤菌。

几株不同种属来源的木麻黄植物根瘤共生放线菌-Frankia的研究

用根瘤切片法,从长骨木麻黄(C. glauca Sieb.)、鸡冠木麻黄(C. cristata)和海滨木麻黄(A. littoralis)野生根瘤中分离出具有侵染能力的Frankia sp、NNCG01、NNCCR03和NNACL05菌株,它们都具有Frankia的典型形态特征,在无氮培养条件下,形成大量的顶囊和孢子囊。各菌株对简单碳源和氮源的利用比对复杂碳源和氮源的利用更好,而且都具有较高的耐盐(NaC1)能力,在0.2M盐浓度中,生长受到的影响很小,在盐浓度为0.5M时,也有一定生长。这三株Frankia菌株都能交叉感染木麻黄属(Casuarina)和异木麻黄属(Allocasuarina)中的一些放线菌结瘤植物,因此,从木麻黄属植物根瘤分离的Frankia菌株和从异木麻黄属植物根瘤分离的Frankia菌株属于同一个互接种簇。这三株Frankia的自生固氮活性与它们的共生固氮活性呈正比,而且同一菌株与不同种木麻黄植物共生固氮的效率没有明显的差异,为初步筛选高效共生固氮的Frankia菌株提供了一个快速简便的方法,具有重要的实际意义。

根瘤内生菌群对南洋楹苗木生长的影响

[目的]探究根瘤内生菌群对南洋楹苗木的促生效应,并揭示根瘤优势内生菌组成及其与苗木生长的关系,为南洋楹菌肥研发提供参考。[方法]以来源于广东广州、惠州和茂名等3个地区的南洋楹根瘤提取液为接种菌液(YZ、YD和YX),开展南洋楹组培苗接种对比试验,并对回接根瘤进行16S rRNA基因测序鉴定和数据分析。[结果]与对照相比,3种接种处理的南洋楹苗木均能成功接根瘤,其苗期生长与结瘤、生物量积累、光合及固氮等相关指标均显著优于对照,其中苗高、根长、相对叶绿素含量和总氮量等表征南洋楹苗木的综合情况的指标分别比对照增加了53.74%~95.65%、52.91%~98.41%、74.04%~86.18%和7.6~15.9倍。3种接种处理中,接种菌液YZ对苗木促生、结瘤和固氮效应最为显著。回接根瘤内生菌群组成存在一定差异,YZ处理的根瘤内生菌的比例最均衡、细菌物种数(OTU数)最多和α多样性(香农指数)最高。根瘤内生菌中一种反硝化Fe-Ⅱ氧化细菌与南洋楹苗高、回接根瘤数呈极显著正相关,与含氮量、总氮量和固氮量呈显著正相关;OTU数和香农指数与南洋楹苗高、根瘤数、总氮量和固氮量等呈极显著或显著正相关关系。[结论]南洋楹根瘤提取液能对南洋楹苗期的生长与结瘤、生物量积累、光合及固氮起到积极的促进作用,不同来源的接种菌液对苗木的促生效应及回接根瘤内生菌群组成存在一定差异,根瘤内生菌种类越丰富、相对丰度越均衡,对南洋楹幼苗促生和固氮作用越显著。

楚雄南苜蓿根瘤菌的鉴定及其耐酸耐铝特性研究

为了获得耐酸铝性强的楚雄南苜蓿(Medicago polymorpha L.)共生根瘤菌菌株,本研究对从不同地区采集到的5份根瘤样品进行分离、纯化和鉴定。对鉴定得到的根瘤菌进行菌体形态观察、低氮回接以及耐酸、铝特性的研究。结果表明:YS-8,YS-10,DH-9,DH-31属于根瘤菌属根瘤菌、CX-44属于中华根瘤菌属苜蓿中华根瘤菌,5个菌株均符合根瘤菌基本形态特征。接种5株根瘤菌后,楚雄南苜蓿的干重、鲜重、株高、结瘤数均显著高于对照(P<0.05);pH值在4.5~7.5范围内,5株菌株均能正常生长,当pH值=3.5时,5株菌株全部死亡;当Al3+浓度在100~1 500 mg·L^(-1)之间,随着Al3+浓度的升高,菌株生长逐渐缓慢,Al3+浓度达到2 000 mg·L^(-1)时,5株菌株全部死亡。分离出的5株根瘤菌均能与楚雄南苜蓿共生结瘤并促进其生长,且具有较强的耐酸铝性。筛选出的5株根瘤菌均能在pH值大于3.5且铝离子浓度(pH值=5)小于1 500 mg·L^(-1)的条件下推广使用,菌株CX-44的效果最佳。

新根瘤菌属模式菌株全基因组序列比较分析

新根瘤菌属(Neorhizobium)隶属于根瘤菌科(Rhizobiaceae),目前有效发布了8个种。为了探究该属下不同模式菌株的全基因组分子机理和遗传特征,本文采用Prodigal等软件对这8个模式菌株的全基因组序列进行基因预测、功能注释和系统发育分析,并在此基础上进行了基因组比较分析。基因组预测结果显示,这8个模式菌株的CDS(Coding Sequences)数量为4471~6669个,GC含量在60.0%至61.6%之间,rRNA数量为3至9个,tRNA数量为43至51个。通过比较基因组分析发现,所有菌株共享的直系同源基因簇有2563个,独立拥有的基因簇数量少。通过平均核苷酸一致性(ANI)、数字DNA-DNA杂交(dDDH)和系统发育树的分析,发现菌株CCBAU 05176^(T)和菌株T17_20^(T)具有最高的同源性,而菌株T786^(T)和NTR19^(T)的遗传距离最远。COG(Cluster of Orthologous Groups of Proteins)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分类的比较分析显示,注释的基因功能整体差异较小,但在SL-1T中,异种生物的生物降解和代谢的注释比例和数量明显高于其他模式菌株。本研究为新根瘤菌属的系统分类以及在生态系统中的应用奠定了理论基础。

色赤杨根瘤内生菌Frankia sp,At^4的分离和侵染能力的鉴定(简报)

放线菌与非豆科木本植物的共生体系具有强大的固氮能力,可将大气中氮素转变成化合态,以满足植物需要,并培肥土壤,在绿化造林中起着重要作用。近年来,国内外均在积极开展这方面的工作,使其成为固氮研究中最活跃的领域之一。最近,我们已从色赤杨根瘤中分离到了几株Frankia放线菌,并进行了形态学和宿主植物回接结瘤等方面的鉴定工作。已证实At4是一株能使色赤杨结瘤固氮的Frankia菌株。

基于高通量测序分析苗药血人参根和根瘤内生菌的多样性

目的:探究血人参根和根瘤内生细菌的组成差异,筛选优势内生菌菌株。方法:通过对16S rRNA基因进行高通量测序,对血人参根及根瘤中内生菌进行物种注释、分类、物种多样性和组间差异分析。结果:血人参根和根瘤内生菌总计含有5 574个OTU,隶属于30门79纲192目324科587属。根部的内生菌总计有5 518个OTU,在门分类水平上相对丰度较高的主要为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteriota,在属水平上相对丰度较高的为游动放线菌属Actinoplanes和norank_f__Kineosporiaceae属,其平均相对丰度分别为18.60%、10.05%;根瘤中内生菌总计有895个OTU,在门分类水平上相对丰度较高的为变形菌门Proteobacteria,在属水平上慢生根瘤菌属Bradyrhizobium占据绝对优势,其平均相对丰度为97.87%。血人参根瘤中内生菌的Shannon、ACE及Chao指数均显著低于根中(P<0.05)。根瘤内参与氨基酸的转运和代谢,细胞的复制、重组和修复,细胞的生物发生等功能菌群相对丰度较高。结论:血人参根瘤中内生菌以埃氏慢生根瘤菌和大豆慢生根瘤菌为主,且与根部相比,物种多样性水平低、群落结构更为单一、物种分布不均匀。

抗菌肽基因转化樱桃矮化砧木获得抗根瘤病的转基因植株

建立了樱桃（PrunuspseudocerasusLindl．）矮化砧木茎尖高频再生系统，并利用根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens（SmithetTownsend）Conn）介导将gus及抗菌肽基因导入樱桃矮化砧木，获得19个转化株系。经Southernblot检测证明，抗菌肽基因已整合到樱桃的基因组。转基因植株接瘤实验、gus基因表达产物的颜色反应及叶片提取液对根癌土壤杆菌C58的抑菌实验表明，抗菌肽基因在转化植株中可能已得到有效表达，试管苗具有明显的抗根瘤病特性。还研究了茎尖分生组织的种质转化特点，结果表明它是一个较好的转化系统，可获得较高的转化频率。

溶磷性大豆根瘤内生菌的筛选、抗性及系统发育和促生

对采自河南省不同地区的大豆根瘤进行内生菌分离纯化、溶磷性筛选试验。根据能否产生溶磷圈及溶磷圈直径(D)、菌落直径(d)和D/d值大小确定菌株溶磷能力,采用钼锑抗比色法测定培养液中有效磷含量;平板筛选法对筛选菌株进行耐盐性、耐酸碱、重金属等抗性测定,并对筛选菌株进行理化特性、16S r DNA、rec A序列和系统发育分析。结果表明,从分离纯化的324株内生菌中筛选出36株具有溶磷特性,其中20株有较强溶磷性。菌株DD291发酵液中可溶性磷含量最高(452 mg/L),发酵液p H与对照相比均有不同程度下降,最大降幅达2.92。大部分溶磷性内生菌具有较强耐盐碱性,对Pb2+、Cr6+和Cu2+有较高耐受性,对Ni2+和Hg2+抗性较弱。结合细胞形态、生理生化、16S r DNA、rec A序列和系统发育分析结果,菌株确定为Bacillus cereus,Enterobacter cancerogenus,E.cloacae和Pseudomonas putida。部分溶磷菌株对大豆的生长有促进作用,显示出潜在的应用前景。

黄淮海地区优良大豆根瘤菌株的筛选与接种方式研究

采用蛭石盆栽和土壤盆栽试验,从黄淮海3省11个地区的22株大豆根瘤菌中筛选与大面积种植的大豆品种阜豆9765相匹配的优良菌株,并在田间进行了根瘤菌3种接种方式的效果比较试验。以根瘤菌结瘤数量、植株干重、植株全氮量和占瘤率为指标,通过蛭石盆栽试验初筛获得与阜豆9765共生匹配效果好的根瘤菌6株;进一步的土壤盆栽复筛结果表明:菌株Bradyrhizobium japonicum 4302和Sinorhizobium fredii 4822在结瘤能力、固氮能力和竞争能力方面强于其它4株根瘤菌,说明B.japonicum 4302和S.fredii 4822具有良好应用前景。在田间进行的根瘤菌拌种、喷施和种下接种的3种接种方式小区试验中,拌种处理在大豆植株干重、植株全氮量、占瘤率和产量等方面均显著高于另2个处理和对照,说明大豆根瘤菌的拌种方式更适用于黄淮海地区大豆种植。

黄土高原地区优良大豆根瘤菌的筛选与接种方式研究

采用蛭石和土壤盆栽试验,从黄土高原地区17个大豆品种上采集根瘤,对根瘤进行分离纯化、回接验证和遗传多样性分析,根据遗传多样性分析结果、分离宿主和分离地点,选出代表菌株用于筛选与黄土高原地区面积种植最大的大豆品种晋豆25相匹配的优良菌株,并在田间进行了根瘤菌喷施、拌种和种下接种不同接种方式效果比较试验。以瘤数、瘤干重、植株干重、植株全氮量为指标,通过蛭石盆栽试验初筛获得与晋豆25共生匹配效果好的根瘤菌10株;其进一步的耐旱试验和土壤盆栽复筛结果表明:菌株Bradyrhizobium liaoningense 4345和Sinorhizobium fredii 4338在结瘤能力、固氮能力、竞争能力和耐旱性能方面最好,揭示B.liaoningense 4345和S.fredii 4338具有良好应用前景。在田间进行的根瘤菌3种接种方式小区试验中,B.liaoningense 4345喷施处理在大豆植株干重、植株全氮量、占瘤率和产量等方面均显著高于另2个处理和对照,S.fredii 4338拌种和喷施较好,表明黄土高原地区大豆根瘤菌的适宜接种方式是喷施和拌种。

Frankia菌侵染木麻黄与其共生结瘤程序

通过回接结瘤后定期制作半薄、超薄切片,在光学和电子显微镜下观察研究了分离自浙江省短枝木麻黄Casuarina equisetifolia根瘤的2株Frankia菌的侵染过程。结果表明:Frankia菌从根毛细胞侵入后向内部的皮层细胞延伸,受Frankia菌侵入的刺激,侵染的根毛细胞产生大量电子云密度不等的沉积物。沉积物包裹Frankia菌继续向内侵染,形成"侵染线"穿越细胞壁进入邻近细胞,最终到达根瘤。根瘤产生的时间程序为:接种6 d后Frankia菌已侵染根部细胞;接种12 d后形成了根瘤原基;15 d后根瘤原基的部分薄壁细胞被Frankia菌侵染后,转变为前根瘤;接种24 d后前根瘤进一步生长发育伸长,突出皮层后形成新根瘤并最终发育成成熟瘤。Frankia菌的整个侵染过程为:Frankia菌侵染→形成"侵染线"→形成"界面质"→穿壁→繁殖→泡囊→孢子。根瘤的发育可概括为:根瘤原基→前根瘤→成熟瘤。

耐高氮优良大豆根瘤菌株的筛选与鉴定

采用高氮平板与蛭石盆栽相结合的方法,以黑龙江省农业科学院1979年设立的黑土长期定位试验7种不同施肥处理中分离到的254株大豆根瘤菌为材料,筛选耐高氮的优良大豆根瘤菌。高氮平板结果显示:随着尿素浓度的增加,可生长的菌株数量逐渐减少,其中严重抑制菌株生长的尿素浓度为5 g·L-1,该浓度条件下只有11株菌能够生长,均来自连续施用氮肥的处理。进一步采用模拟高氮环境蛭石盆栽的方法,将能在5 g·L-1尿素条件下生长的11株菌进行复筛,以植株干重、植株全氮量、根瘤干重和数量作为评价指标,获得1株在高氮条件下具有结瘤固氮能力的菌株5841。经16S r DNA序列系统发育分析,初步确定该菌株属于日本慢生大豆根瘤菌(Brandyrhizobium japonicum)。

长白山赤杨根瘤内Frankia的基因多样性分析

采集长白山自然保护区北坡东北赤杨、西伯利亚赤杨、色赤杨根瘤样品 2 1个 ,对根瘤内FrankiaDNA的 16S -2 3SrDNA和nifD -nifK两个基因间隔区段 (IGS)进行PCR -RFLP分析 ,研究其基因多样性。结果表明 :与赤杨共生的Frankia菌存在丰富的基因多样性 ,基因类型与宿主种型关系密切。东北赤杨对Frankia的特异性较高 ,与西伯利亚赤杨和色赤杨共生的Frankia菌有较近的亲缘关系。

不同相思根瘤菌株接种厚荚相思幼苗效应的比较

从不同立地条件的6种相思林中采集根瘤并分离14株根瘤菌,将其接种到厚荚相思幼苗。结果表明,从广西本地分离的土著根瘤菌比对照菌株L1(从中国林科院引进的外来优良菌种)有更好的共生效应。从综合效应看,多数菌株接种的厚荚相思幼苗与对照相比,其苗高生长量增加4.5%～18.6%,地径生长量增加2.5%～46.8%,固氮酶活性提高7.6%～241.8%,叶绿素含量提高11.0%～19.1%,叶片硝酸还原酶活性提高3.3%～34.4%,叶片含氮量提高7.4%～43.8%,叶片含磷量提高9.1%～72.7%,叶片含钾量提高8.3%,叶片含钙量提高7.3%～41.5%,叶片含镁量提高12.5%～25.0%,叶片含铁量提高10%以上。

大豆根瘤菌与促生菌复合系筛选及机理研究

通过溶磷和生长素分泌的定性测定,从大豆根际土壤及实验室保藏菌株中分离筛选植物根际促生细菌(PG-PR),采用大豆根瘤菌和促生菌双接种的蛭石盆栽试验,初筛获得能够促进大豆植株生长、提高大豆根瘤菌结瘤固氮作用的促生菌5株。进一步的土壤盆栽复筛实验表明,筛选得到的5株促生菌与大豆根瘤菌进行双接种,能够在阜阳、济宁和延安的3种土壤中明显提高大豆的根瘤数量、根瘤干重、植株干重和全氮含量,并且能够促进植株对磷素的吸收。溶磷能力定量测定表明,5株促生菌均具有溶解无机磷的能力,有的菌株具有较高的溶磷能力;高效液相色谱法测定促生菌发酵液的成分,结果显示5株促生菌具有产生植物激素和有机酸的能力。经过16S rRNA基因序列分析,所分离的根际促生菌1-3,P7和P13分别属于芽孢杆菌属(Bacillussp.)、叶杆菌属(Phyllobacteriumsp.)和中华根瘤菌属(Sinorhizobiumsp.)。