根癌农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系的优化

为进一步提高根癌农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化效率,本试验以紫花苜蓿(Medicago sativa L.)品种‘中苜1号’为试验材料,通过筛选高效再生的植株,以筛选出的植株叶片为外植体,并通过调节培养基激素配比,在农杆菌侵染过程中添加谷氨酰胺、进行冷处理等措施优化苜蓿由农杆菌介导的遗传转化体系。试验结果表明:转化过程中以嫩叶作为外植体,菌液和重悬液中添加150μmol·L^(-1)乙酰丁香酮,侵染过程中使用300μmol·L^(-1)的谷氨酰胺将瞬时转化效率从32%提高至92%,转化效率提高到31%。研究紫花苜蓿的遗传转化体系可为紫花苜蓿高效遗传改良及基因功能研究提供了技术支持。

根癌农杆菌介导彩色马蹄莲遗传转化体系的建立及优化

【目的】建立及优化根癌农杆菌介导的彩色马蹄莲(Zantedeschia hybrida)遗传转化体系,为提高彩色马蹄莲遗传转化效率及培育彩色马蹄莲抗性品种提供理论参考依据。【方法】将不同外植体(茎基、叶、不定芽)和不同浓度噻苯隆(TDZ)(0.001、0.002和0.005 g/L)进行正交试验筛选外植体和丛生芽增殖培养基;液氮冻融法将pCAM BIA2301和pBI121质粒转入农杆菌LBA4404感受态细胞。以β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因作为农杆菌介导转化测定的报告基因,对彩色马蹄莲的丛生芽进行遗传转化,阳性苗经PCR扩增验证转化结果。通过不同硫酸卡那霉素(Kan)浓度(50、100和150 mg/L)、侵染时间(25、30和40 min)及共培养时间(2和3 d)3因素正交试验筛选最佳转化条件。【结果】外植体为不定芽的丛生芽诱导率极显著高于茎基和叶(P<0.01),当不定芽为外植体、TDZ浓度为0.002 mg/L时,丛生芽增殖倍数(5.12倍)显著高于0.001和0.005 mg/L TDZ处理(P<0.05),筛选出M6培养基+0.002 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖+6.25 g/L琼脂为丛生芽增殖培养基;影响阳性频率因素排序为:侵染时间>Kan浓度>共培养时间。当Kan浓度为50 mg/L、侵染时间25 min及共培养时间为3 d为最优侵染条件,此时,GUS+丛生芽出芽频率和PCR阳性频率最高,分别为54.0%和15.27%。【结论】成功优化彩色马蹄莲遗传转化体系,最佳外植体为不定芽,转化体系最佳组合为Kan浓度为50 mg/L、侵染时间为25 min及共培养时间为3 d。

蓝莓根癌病发生调查及病原鉴定

对辽宁、吉林、山东及黑龙江省的部分蓝莓苗圃及生产园中蓝莓根癌病发生情况、症状特点及危害程度进行了调查,结果表明蓝莓根癌病多见于苗圃及酸度不适的生产园中。在上述地区采集到57份蓝莓冠瘿瘤和10份土壤样品,经过菌株分离、回接寄主后获得19株致病菌。通过菌落形态、菌体特征、生理生化及16SrDNA序列比对,确定蓝莓根癌病是由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染所致。

根癌农杆菌介导籼稻遗传转化影响因素研究

研究了抗生素种类、继代和菌液浓度对农杆菌介导籼稻转化的影响,并将反义蜡质基因导入4个高产、直链淀粉含量高的籼稻品种中。结果显示,羧苄青霉素的抑菌效果优于头胞霉素,其适宜浓度为250￣350mg/L;4个品种继代愈伤比初代愈伤能获得更高的抗性愈伤得率;各个品种转化有其最佳的农杆菌菌液浓度(OD600值),茉莉新占和绿黄占为1.0,粤香占和矮秀占为0.6。应用此优化的农杆菌转化体系,我们得到了转化植株;PCR扩增和Southern杂交结果证明外源基因已经整合到转基因水稻的基因组中。

一些杀菌剂和抗菌素对根癌菌和根癌抑制菌的作用

采用抑菌留法测定了6种杀菌剂和抗菌素对不同生物型根瘤上壤杆菌及其抑制菌的作用。结果表明，福美双对生物Ⅲ型根癌菌所有菌株都有较强抑制作用，抑菌圈直径（DBA）最大达23．2mm，对Ⅰ，Ⅱ型的个别菌株也有轻微抑制作用；多菌灵、乙磷铝和加瑞农对3种生物型的根癌菌无抑制作用；青霉素钠对Ⅰ，Ⅱ型根癌菌无抑制作用，对Ⅲ型抑制作用较强，最大DBA为27．0mm。硫酸链霉素对Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型根瘤菌抑制作用显著，DBA最大值达40．8mm。对于根癌抑制菌，福美双在＜1000μg·g-1时．对K84和E26无作用，对HLB－2作用微弱，DBA为11．7mm。多菌灵、乙磷铝对3种根癌抑制菌均无作用。加瑞农对K84无作用，对E26和HLB－2作用轻微，最大DBA分别为13．2mm和10．2mm。青霉素钠对K84，HLB－2无作用，对E26的最大DBA达375mm。硫酸链霉素对HLB－2和E26无作用，对K84的最大DBA达26．2mm.

E26防治植物根癌病的效果及其稳定性初步研究

选取不致病的葡萄土壤杆菌 (Agrobacterium vitis) E2 6菌株 ,以 HL B- 2和 K84菌株做对照 ,对不同来源的 36株根癌菌进行室内及温室条件下的抑菌及防治效果试验。结果表明 :室内抑菌检测中 ,E2 6的抑菌谱要广于 HL B- 2和 K84 ,对 36株根癌菌中的 30株有拮抗作用 ,抑菌率为 83.3%。在温室防治检测中 ,生防菌与根癌菌 1∶ 1混合接种指示植物向日葵时 ,E2 6对 85.7%的供试菌株有防治效果 ;与对照生防菌相比 ,尤以防治葡萄根癌病最为有效。单菌落传代研究表明 :E2 6后代菌株与初始菌株在产素及生长速度方面均无显著差异 ,表明 E2

中国葡萄野生种对葡萄根癌病的抗性

通过田间接种鉴定，系统研究了中国葡萄属１３个种和变种的２６个株系对葡萄根癌病的抗性，筛选出高抗株系１０个。其中燕山葡萄（♀）因扦插容易生根，可用自根苗作为抗葡萄根癌病砧木进行嫁接试验。

38份桃及其野生近缘种抗根癌病评价

【目的】筛选桃抗根癌病种质,为抗病育种提供抗性材料。【方法】通过苗木接种强致病力根癌土壤杆菌,60 d后测定最大瘿瘤直径,评价不同材料的抗病性,并以聚类分析确定各抗性等级的界限。【结果】对38份桃及其野生近缘种的972个单株的抗根癌病能力进行评价,结果表明,每个群体中个体间均存在不同程度的抗性差异;其中伏牛山望10、蒙古扁桃、四道岭野生李、‘寿粉’4个群体高度抗病;广元1号等14个群体中度抗病;‘西伯利亚C’等16个群体中度感病;林州天平山-1等4个群体高度感病;群体变异系数为24.3%~201.4%,高度抗病的4份材料群体的变异极大。【结论】供试材料中不存在免疫个体,伏牛山望10、蒙古扁桃、四道岭野生李、‘寿粉’等为高抗根癌病种质。

新疆桃对桃树根癌病的抗性评价

为评价新疆桃对桃树根癌病的抗性,以2年生实生新疆桃新梢为试材,采用人工接种方法,研究了新疆桃对桃树根癌病的抗性。结果表明,新疆桃在接种后60天,接种发根土壤杆菌的株最大瘤径0～10.1 mm,平均为3.4 mm;接种根癌土壤杆菌的株最大瘤径0～9.4 mm,平均为3.7mm,接种2种菌后株最大瘤径0～10.1 mm,平均为4.6 mm,根据抗性评价标准判定新疆桃中抗发根土壤杆菌,中抗根癌土壤杆菌,即新疆桃对桃树根癌病抗性为中度抗病。新疆桃对桃树根癌病的抗性存在显著的分离现象,对桃树根癌病免疫、高度抗病、中度抗病、低度抗病、感病和易感病型植株分别占群体总数的1.32%、11.84%、52.63%、26.32%、6.58%和1.32%。新疆桃是桃砧木抗根癌病品种选育的珍贵种质资源。

土壤杆菌K1026对果树根癌病的生物防治（英文）

由致病性根癌土壤杆菌Agrobacterium spp.侵染引起的根癌病对山东及我国其他省份的樱桃、桃及其他果树生产造成严重的影响。土壤杆菌Agrobacterium rhizogenes K1026在澳大利亚已制成生防菌剂并在全球多个国家实现商品化,但在我国果树育苗和生产行业中还未得到广泛应用。本文从山东樱桃和桃树根癌组织及感病土壤中分别分离到100余株致病性土壤杆菌,经鉴定均属于生物Ⅱ型土壤杆菌;利用双层平板抑菌试验,检测了37株病原菌对菌株K1026的敏感性,结果显示,所有菌株均对K1026产生的抗生物质敏感,可以在Stonier’s培养基上产生5种以上不同类型的抑菌圈;胡萝卜切片试验显示,菌株K1026可完全抑制37株病原菌对胡萝卜的致瘤活性。上述结果为土壤杆菌K1026用于山东省樱桃及桃树根癌病的生物防治奠定了基础。

引进生防制剂防治我国果树根癌病 Ⅰ.病害的基本调查和病原菌的分离鉴定

调查了我国部分地区农场、果园、苗圃、林场根癌病,得知根癌病(Agrobacteriumtumefacfens)普遍为害我国多种果树、林木,并且发病十分严重。几乎重茬苗圃土壤都带有根癌病菌。病菌的分离鉴定表明,葡萄的根癌土壤杆菌主要是生物3型,没有发现生物2型。鉴定中还发现苹果上也有生物3型的根癌土壤杆菌。

桃品种资源抗根癌病评价

为了明确不同桃品种对根癌病的抗性,挖掘抗病基因,为抗病育种提供抗源材料。采用嫁接苗枝条接种强致病力根癌土壤杆菌AT4-3,60d后测定最大瘿瘤直径评价不同材料的抗病性。对179个桃栽培品种的抗根癌病能力进行评价,结果表明,不同品种的瘤直径平均值分别为3.44～25.48mm(2014年)和5.89～31.40mm(2015年);在2014年的抗性鉴定中,高度抗病材料1份,来源于华北平原区品种群,中度抗病材料20份;在2015年的抗性鉴定中,中度抗病材料2份,分别来源于华北平原区品种群和西北干旱区品种群。2a鉴定中抗性表现较好且稳定的品种有‘二接白’‘肉蟠桃’‘绯桃’‘红桃’‘砂子早生’‘南山甜桃’‘深州离核水蜜’‘张黄9号’‘鸳鸯垂枝’‘临白10号’等。

上海地区果树根癌病发生与土壤环境的关系

果树根癌病(致病菌为根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens)目前在上海地区大面积发生,严重危害桃(Amygdalus persicaL.)、梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)、苹果(Malus pumila Mill.)等果树的生长。本文采用化学分析及微生物培养等方法,研究了上海地区桃树和梨树根癌病的发生与土壤因子(土壤含水量、pH值、有机质含量),土壤细菌以及与不同果树品种之间的关系。结果表明:土壤含水量、pH值、有机质含量、土壤中微生物的多样性和微生物总体数目与病害的发生没有显著的相关性,但是土壤中存在的个别菌种对病害的发生有显著的影响,初步分析显示Agrobacterium sp.和Bacillus sp.对根癌病的发生具有抑制作用,而Psuedomonas sp.对根癌病的发生可能具有一定的促进作用。同时不同果树品种的病害发生率之间有显著性的差异。

根癌农杆菌胁迫下多花蔷薇(Rosamultiflora‘Inermis4’)的基因表达分析

多花蔷薇无刺4号(Rosamultiflora‘Inermis4’)对根癌病有较强抗性。以根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)接种多花蔷薇无刺4号为目的材料,刺伤处理为对照,采用抑制差减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)方法,构建了富集多花蔷薇根癌病抗性相关基因的差减cDNA文库。差异筛选差减cDNA文库后,随机选取增强表达的92个克隆进行测序,去除冗余的cDNA和病菌的基因片段,共得到53个单一序列。利用GenBank数据库进行核酸和蛋白质同源性比较,获得的cDNA片段功能涉及:细胞分裂、生长(22个克隆),逆境防御、信号转导及激素调节(11个克隆)以及初生与次生代谢(10个克隆)。另有10个基因片段功能未知,可能为新的EST。根据测序及比对分析结果,对多花蔷薇无刺4号抗根癌病的分子机理进行了探讨。

转座子Tn5对葡萄根癌病生防菌MI15的诱变

以含自杀性质粒pMO75::Tn5的铜绿假单胞菌PAO1826和含自杀性质粒pSUP2021::Tn5的大肠杆菌S17-1为供体菌,以葡萄根癌病生防菌MI15为受体菌,进行接合杂交.当供体菌和受体菌菌体数量比例为1∶1和1∶5时可以产生转移接合子,而当菌体数量比例为5∶1时不能产生转移接合子.共筛选了117株转移接合子,获得了3株不产细菌素的MI15突变株,用光敏生物素标记的Tn5DNA探针与突变株染色体DNA进行斑点杂交,3株突变株均呈阳性反应,证明Tn5转座子已插入到MI15菌株的染色体上引起插入突变并抑制了细菌素的产生.

樱桃根癌病防治试验

根癌病是一种世界性植物细菌病害，是由土壤中的根癌土壤杆菌通过植物根或茎的伤口入侵后形成的，该病菌侵染后，导入T—DNA，与樱桃根系细胞的DNA结合，此基因表达，引起细胞的不断分裂复制，在侵染部位形成肿瘤。这种菌在土壤中的含量极为丰富，世界各地均有发生，而且寄主相当广泛，可侵染93科331属643种高等植物，在我国桃树、樱桃、葡萄等多种果树受到根癌病危害，尤其以樱桃最为严重。

果树根癌病生物防治研究进展

根癌病是由根癌农杆菌引起的细菌性病害.阐述了根瘤菌致病机制和生物防治的研究进展,对其今后的研究方向作了概述.

剖析樱桃三大病害——根癌、根颈腐烂、流胶

自古就有“樱桃好吃树难栽”的说法．此说法流传甚广．与樱桃生产中的三大病害——根癌、根颈腐烂、流胶密不可分，这三种病害中。病因最明确的是樱桃根癌病．是由土壤中的根癌土壤杆菌引起；根颈腐烂病，烟台市农科院大樱桃所目前分离到5种真菌：樱桃流胶病，不同的学者分离到的病菌不同，真菌、细菌并存，生理、病理交织在一起。本文参考国内最新研究进展．结合自己多年试验研究情况．对三大病害进行剖析。

核果类果树根癌病菌寄主范围及抗性研究初报

2000年11月从山东泰安、临朐、诸城等地采集冠瘿瘤标本,经分离纯化及在指示植物向日葵上的致病性测定,共分离到致病性病原菌8株。经对26种供试植株的接菌试验,发现有20种植株得病。基于同一砧木或品种类型对不同菌株的抗性程度往往幅度很大,应采用多种菌株进行侵染试验。对8种樱桃砧木的抗性研究发现,不同砧木对不同致病菌的抗性不同。

苹果根癌病防治技术

1病原及症状 病原为杆状细菌，菌体长1．2～5um，宽0．6-1um，有鞭毛1～3根，单极生有荚膜，不形成孢子，革兰氏染色阴性。病菌发育温度10～34℃，适温23℃，pH值范围5．7～9．2，最适pH值7.3。根癌土壤杆菌分为3种生物型，生物I型、生物II型寄生范围较广，包括苹果、梨、桃等多种果树。