通过根癌农杆菌介导法将抗虫基因CpTI导入辣椒的研究

研究建立了一套简单、高效的辣椒遗传转化系统。利用根癌农杆菌介导的带柄子叶转化法将豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)基因转入辣椒栽培品种益都羊角椒中。对获得的 3 3株卡那霉素 (Km)抗性再生植株进行PCR检测 ,证明有

根癌农杆菌介导法获得烟草转人骨形成蛋白-3成熟肽基因植株

利用冻融法将质粒 p CAMBIA- h BMP- 3 m直接转入根癌农杆菌 LBA440 4 ,以烟草无菌苗叶盘为外植体 ,通过农杆菌介导法进行遗传转化 ,获得了在含 2 5 mg/L潮霉素 (Hy-gromycin,Hyg)的筛选培养基上再生的抗性植株 ,经 PCR检测呈阳性 ,初步鉴定并筛选整合了人骨形成蛋白 -

根癌农杆菌介导β-1,4-半乳糖苷转移酶基因转化大豆及其转基因植株再生

以大豆下胚轴为外植体 ,通过根癌农杆菌介导转化法 ,建立起良好的转化系统 ,将人的 β -1 ,4-半乳糖苷转移酶基因 (hGT)导入大豆。经转化的外植体在添加 1 0 0mg/L氨苄青霉素和 5 0mg/L卡那霉素的选择培养基中可诱导出愈伤组织和芽再生 ,在 1 /2MS培养基上诱导生根 ,并培养成再生苗 ,获得了完整的抗性再生植株。进行Southernblot分子杂交鉴定 。

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化

综述开展甘蔗基因工程育种工作20多年来,从最初的利用农杆菌介导法研究抗除草剂和抗虫转基因成功,到目前高转化效率的转基因方法应用过程中取得的成果,分析影响农杆菌转化甘蔗的关键因素,并对农杆菌介导的甘蔗遗传转化研究前景作了展望。

根癌农杆菌介导的香蕉高效遗传转化系统的建立

为建立根癌农杆菌介导的香蕉高效遗传转化系统,本研究以雄性花诱导产生的贡蕉胚性悬浮系为转化受体,从潮霉素筛选浓度和筛选方法两方面进行了优化。研究结果表明,贡蕉悬浮系在M2液体培养下潮霉素的适合筛选浓度为5mg/L。将液体共培养7d后的贡蕉胚性悬浮系转接到M2液体筛选培养基进行培养,每10d继代一次。GUS组织染色表明,经过3代抗性筛选的ECS几乎全为转化细胞。经过3个月的胚诱导培养获得成熟抗性体细胞胚,平均抗性体细胞胚得率为4580个/mLPCV。同时,转化苗的PCR检测结果表明,gus基因已整合到贡蕉基因组中。本研究表明液体筛选系统有利于转化胚性悬浮细胞的增殖,大大地提高了香蕉转基因的转化效率。

农杆菌介导的中国水仙遗传转化体系的建立

利用根癌农杆菌介导法将 GUS基因导入中国水仙 ,组织化学法检测转化后共培养 3d的水仙鳞茎盘组织块 ,GUS基因瞬时表达很好 ,90 %以上的材料呈现大面积的蓝色斑块 ,取筛选培养 2 0d的材料检测 GU S基因的稳定表达 ,约 1%的组织块有蓝色反应 .水仙预培养 10 d后转化 ,转化前在菌液中加入 60 μmol/ L AS活化 2～ 3h,转化率提高了两倍以上 .转化材料在 MS+ BA10 + NAA0 .2+ Cef30 0 + Hyg30 培养基上培养 2 0 d左右分化出小鳞芽 ,频率约为 60 % ,组织块平均出芽 5 .7个 ,最多可达 14个 ,小鳞芽 10 d后长成小鳞茎 .

农杆菌介导慈竹4CL基因遗传转化梁山慈竹

以梁山慈竹2种类型成熟胚的愈伤组织为材料,采用农杆菌遗传介导的方法,将已构建好的具有降低木质素含量的PBI121-4CL-RNAi表达载体导入愈伤组织,探讨愈伤组织预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和温度对遗传转化的影响。研究结果表明,淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组织是较好的遗传转化材料。以在愈伤组织培养基上预培养8天的淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组织为转化受体,在菌液浓度为OD600=0.05的EHA105中侵染20min后,在25℃、黑暗条件下共培养2天(共培养基表面加一层无菌滤纸),在含有卡那霉素为55mg.L-1的抗性筛选培养基上筛选30天,抗性愈伤组织率为90%,经PCR检测,慈竹4CL基因已导入梁山慈竹愈伤组织中。抗性愈伤组织在芽诱导培养基上诱导30天,可获得丛生芽,待丛生芽长至3～5cm后,在生根培养基上经过20～30天的诱导,可产生1～8条根,获得再生植株。经PCR检测,慈竹4CL基因已导入梁山慈竹再生植株中,获得了转基因植株,转化效率为9%。RT-PCR检测结果表明,转4CL基因的梁山慈竹愈伤组织和植株的内源4CL基因的表达受到抑制,且表达量比对照明显降低。

影响农杆菌介导的辣椒基因转化因素的研究

试验设置农杆菌类型、辣椒基因型、外植体、vir基因活化培养基、方法5个因素,研究了利用根癌农杆菌介导法辣椒遗传转化的效果.以获得Km抗性芽外植体频率为指标,发现农杆菌菌株类型和辣椒基因型对转化效率都有较大影响,直接影响着转化效率.采用预培养2d的子叶外植体,用农杆菌侵染5～7min,可获得最高的转化效率.

处理时间对农杆菌介导甘蓝转化中抗性芽分化率的影响

以甘蓝下胚轴为材料,研究根癌农杆菌转化过程中预培养、感染、共培养各阶段中处理时间对出愈率和抗性芽分化率的影响。结果表明,不同阶段处理时间对甘蓝的出愈率和转化效率有明显的影响,甘蓝转化过程中预培养、感染、共培养的最佳处理时间分别为36h、5min、48h。

八氢番茄红素合成酶基因(PSY)对大豆的遗传转化

以三个大豆品种的无菌苗子叶节为受体,以 PSY为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对大豆进行了遗传转化,经子叶节丛生芽诱导、茎伸长培养、生根培养和潮霉素选择培养,获得了完整的抗性再生苗,经PCR和PCR-Southern分析鉴定,初步证明外源基因 PSY已整合到大豆的基因组中,并对影响遗传转化的因子进行了研究。

抗冻蛋白(afp)基因表达载体的构建及对香蕉胚性细胞悬浮系的转化

通过PCR从‘京都七寸人参'胡萝卜基因组DNA中扩增抗冻蛋白基因,测序结果表明该基因的核苷酸序列与从宁夏‘吴忠'胡萝卜中克隆的完全一致。先后将获得的胡萝卜afp基因克隆和亚克隆至pMD18-T和pBI121,构建植物表达载体pBI121-afp。通过冻融法将pBI121-afp导入根癌农杆菌EHA105中。以香蕉栽培品种‘北大矮蕉'的胚性细胞悬浮系为受体,采用农杆菌介导法将胡萝卜afp基因导入其中,然后在Kanamycin的选择压力下通过体细胞胚发生途径进行植株再生。共获得抗性再生植株9株,其中两株经PCR检测呈阳性,可初步确定目的基因已经整合到这两株转基因香蕉植株的基因组中。

转BG2基因黑杨植株的获得

利用根癌农杆菌介导法将 β - 1,3-葡聚糖酶基因 (BG2 )转入黑杨G1。本研究建立了黑杨G1的继代及高频再生系统 ,对传统农杆菌侵染方法进行了改良 ,通过抗生素筛选获得大量抗性植株。对抗性植株进行了PCR和PCR -Southern杂交鉴定 。

Cry1Ac和sck双价抗虫基因遗传转化甘蔗的研究

将双价抗虫基因,即修饰的苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因(Cry1Ac)和修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入甘蔗优良品种ROC22,获得潮霉素抗性转化植株95株,35株能检测到外源抗虫基因,获得的13株RT-PCR双基因均呈阳性的甘蔗植株,斑点杂交检测有4株呈阳性。结果表明:外源抗虫基因已导入甘蔗基因组中。

转反义磷脂酶Dγ基因白三叶草的获得

利用根癌农杆菌介导法将反义磷脂酶Dγ基因 (PLDγ)转入白三叶草。建立了白三叶草的继代及高频再生系统 ,对传统农杆菌侵染方法进行了改良 ,通过抗生素筛选获得大量抗性植株。对抗性植株进行了PCR和PCR Southern杂交鉴定 ,证实PLDγ基因已整合入白三叶草核基因组中。

植物游离小孢子及其培养所获得的组织在遗传转化中的应用

植物游离小孢子及其培养所获得的组织是植物基因工程中优良的受体,它们具有单倍性和较高胚胎发生能力的特性。因此,以它们为受体构建遗传转化体系可以快速获得纯合的转基因植株。通过综述植物游离小孢子及其培养所获得的胚状体、愈伤组织作为转化受体在根癌农杆菌介导法、基因枪轰击法、激光微孔穿刺法、显微注射法、电激法、PEG介导法等转化技术中的应用研究进展,对目前游离小孢子作为转化受体存在的问题及发展前景进行了探讨。

hBMP-3m基因在烟草中的表达

PCR扩增人骨形成蛋白-3成熟肽 hBMP-3m cDNA,纯化后连接入pUC19质粒,构建克隆载体pUC19B3m;用EcoR 和Hind 酶解pUC19B3m和pJIT163,将目的片段插入pJIT163,构建中间载体pJIT163-B3m;再构建植物表达载体pCAMBIA1300-B3m.利用冻融法将质粒pCAMBIA-hBMP3m转入根癌农杆菌 A-grobacteriumtumefaciens LBA4404.以烟草 NicotianatabacumL. 无菌苗叶盘为外植体,通过根癌农杆菌介导法进行遗传转化,获得了在含25mg/L潮霉素 Hygromycin,Hyg 的筛选培养基上再生的抗性植株,经PCR证实其中部分植株已将人骨形成蛋白-3成熟肽基因整合到烟草基因组中,WesternBlot结果表明已有微量BMP表达.

绿色荧光蛋白基因转化柑橘胚性愈伤组织与高效再生

采用根癌农杆菌介导法对13份柑橘胚性愈伤组织进行绿色荧光蛋白基因(gfp)的转化,短时间内获得了温州蜜柑、橘橙杂种GWZ等11份柑橘材料的82个转化细胞系,其中佛罗斯特脐橙和日辉橘最易转化,分别获得28个和25个转化细胞系。选取3份材料的不同转化细胞系进行gfp的PCR分析,均获得了预期的gfp片段。研究表明,GFP标记可以在转化早期快速检测并分离转化子,及时剔除逃逸体,获得纯合的转化系;高水平的gfp表达不影响转化细胞增殖、生长和分化。这些带有GFP标记的转化细胞系为柑橘的有关基础研究提供了良好的试材,目前正用于柑橘体细胞杂交和不同倍性愈伤组织的社会化控制现象与机理等研究。

秦烟遗传转化体系的优化

【目的】优化烟草的高效遗传转化体系。【方法】以陕西地区广泛种植的烟草品种秦烟98为试材，采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens，LBA4404）介导法，将从酿酒酵母细胞中克隆到的具有较强耐盐表型的HAL1基因进行遗传转化，对农杆菌介导的遗传转化条件及其影响因素进行研究。【结果】用50mg／L卡那霉素（Kan）筛选转化外植体用800mg／L羧苄青霉素（Cb）除菌可以获得理想的筛选和除菌效果。以优化的农杆菌介导烟草叶片的遗传转化条件为：将未经过预培养（预培养0d）的外植体用稀释150倍的农杆菌菌液（OD600=0．5）浸泡15min，转至MS1培养基上共培养48h，用无菌水冲洗后于体积分数2％NaCIO中浸泡15min，用无菌水冲洗4～5次，置800mg／LCb＋质量分数0．1％的甘露醇中浸泡约12h除菌。【结论】获得了农杆菌介导烟草叶片遗传转化的最佳优化条件，有效地减少了外植体的污染率，提高了抗性芽分化率。

玉米遗传转化的研究

本文就近几年来根农癌杆菌介导法、基因枪法、子房注射法、花粉管通道在玉米基因转化中的应用情况加以综述．

一个烟草葡糖基转移酶基因启动子的克隆与诱导表达

中南民族大学生命科学学院李静、刘学群和王春台3位科研工作者利用从烟草中克隆的一个葡糖基转移酶基因（GT—like），通过PCR扩增得到该基因开放阅读框5’端-1150～0上游调控区，经序列分析表明该启动子序列含有多个基因表达调控元件。将GT—Like基因启动子与gus报告基因连接，构建植物表达载体pGT-gus，经根癌农杆菌介导法转化W38型烟草。转基因烟草植株GUS组织化学染色结果表明：