利用GUS基因的瞬时表达优化大豆根癌农杆菌介导的遗传转化

高转化效率是分子育种的重要前提,根癌农杆菌介导的遗传转化由于其有较高的遗传效率和较低的拷贝数成为目前优选方法。为优化大豆遗传转化体系,以本实验室已有转化体系为基础,利用pCAMBIA3301中35S∶GUS基因瞬时表达体系,从萌发时间、切豆方法、侵染时间、共培养方式以及共培养时间等方面对东农47、垦农18和B12088大豆栽培品种的遗传转化体系进行优化。结果表明:东农47萌发1 d,侵染30 min;垦农18和B12088萌发12 h,侵染30 min,GUS基因瞬时表达率最高。在其它的处理上,3个品种表现结果一致,即蘸取菌液切豆,共培养中子叶伤口朝下摆放,黑暗条件下共培养3～5 d,GUS基因瞬时表达最高。3个品种在最适条件下,GUS染色效率均达到90%以上,垦农18遗传转化效率较高。本研究为大豆农杆菌介导子叶节转化方法提供了一个改进的方案,并且为拓宽可利用于大豆遗传转化的种质资源奠定基础。

根癌农杆菌介导转化甘蓝型油菜子叶GUS基因瞬间表达

为提高根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化甘蓝型油菜外源基因的瞬间表达率和优化遗传转化体系,利用根癌农杆菌共培养法转化甘蓝型油菜(Brassica napusL.)湘油15带柄子叶,通过组织化学染色法检测GUS基因瞬间表达情况,研究了预培养基、蔗糖浓度、无机盐浓度和乙酰丁香酮对GUS基因瞬间表达的影响。结果表明,预培养基为MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L、菌悬液为MS+蔗糖30g/L+乙酰丁香酮100μmol/L或1/2MS+蔗糖60g/L+乙酰丁香酮100μmol/L时GUS基因瞬间表达率较高,达到约40%。

根癌农杆菌介导脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达

黑曲霉(Aspergillus niger)具有高效的蛋白表达和分泌能力.为实现异源蛋白在无孢黑曲霉中的高效重组表达,在优化遗传筛选标记的基础上,建立了根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标记的黑曲霉转化体系.利用该体系介导米黑根毛霉脂肪酶(RML)转化黑曲霉SH-1,通过PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等确定成功获得了RML的黑曲霉转化子,并通过发酵条件优化实现了RML的高效表达,对硝基苯酚比色法测得转化子酶活最高可达15 U/mL,是其在酵母中表达水平的10倍以上.

农杆菌介导注射法建立番茄子叶瞬时表达系统

背景:转基因植物生产口服疫苗具有较大的优势及广阔的应用前景。目前,关于番茄瞬时表达系统的研究罕见报道,对番茄瞬时表达条件进行优化,可使植株的遗传转化效率大幅度提高。目的:利用农杆菌介导的注射法,建立番茄子叶瞬时表达系统,检测植物表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8中外源基因的转录水平。方法:通过对番茄无菌苗的培育,观察不同番茄品种的出芽数、成苗数及农艺学性状的差异显著性,筛选出适用于此实验的番茄品种,将前期构建的植物表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8转化到农杆菌EHA105中,通过对番茄子叶、注射农杆菌浓度、农杆菌注射量、生长苗龄以及共培养天数进行筛选,建立农杆菌介导的番茄子叶瞬时表达系统,观察报告基因的转录水平。结果与结论:初步建立番茄子叶瞬时表达系统,筛选出适合的番茄品种为欧洲大红(苹果型),选材部位为番茄的子叶,注射农杆菌浓度A600为0.2-0.7,农杆菌注射量为50μL,苗龄为7-10 d,共培养24-48 h。该实验为后期外源基因蛋白表达分析研究提供一种方便、快捷和有效的方法。

根癌农杆菌介导VirE2-N-EGFP在2种茄科植物中的表达分析

为了明确根癌农杆菌介导的外源蛋白在茄科植物叶片细胞中能否瞬时表达,克隆了土壤根癌农杆菌的Vir E2基因,并融合至绿色荧光蛋白(EGFP)的N端,成功构建p PZP-Vir E2-N-EGFP植物表达载体。以茄科的本氏烟为对照,根癌农杆菌介导在辣椒和番茄叶片细胞中进行了表达分析。用共同聚焦显微镜可以在本氏烟和辣椒叶片细胞中观察到绿色荧光,而在番茄叶片细胞中未观察到。表明外源蛋白Vir E2-N-EGFP可以在辣椒叶片细胞瞬时表达。该研究结果为进一步研究辣椒中与植物病原互作基因的功能奠定了基础。

影响根癌农杆菌介导的香蕉基因转化早期的主要因素

用含质粒载体pCAMBIA2 30 1的根癌农杆菌 (Agrobacteriuminoculation)转化“6 4 1”香蕉 (MusaAAACavendishsubgroupcv.6 4 - 1)的薄片外植体 ,通过测定GUS基因瞬时表达率 ,对转化早期的主要影响因素进行了研究。结果表明 :农杆菌EHA10 5较适合于介导转化。将薄片置于固体高渗培养基上培养 4h后 ,通过真空减压法使农杆菌接种于其上 ,获得了较高的瞬时表达率 (41 6 7% ) ,是对照 (8 33% )的 5倍 ,农杆菌悬液稀释 5倍用于转化较好 ,共培养 3d为宜。薄片外植体越靠近根部 ,瞬时表达率越高。而外植体预培养会降低瞬时表达率。

根癌农杆菌介导转化获得耐逆性增强的高羊茅转基因植株

为改良草坪型高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)的耐逆性,以成熟种子来源的胚性愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法将拟南芥(Arabidopsis thaliana)耐逆相关CBF1基因导入4个供试品种的基因组,经GUS染色、PCR检测和Southern杂交分析验证,获得了112株转基因植株,转化频率为0.92%～2.87%,不同品种间存在差异.试验表明,在高盐与高渗胁迫下,转基因植株具有显著生长优势,存活率极显著高于非转化对照植株,经低温、高温、干旱和高盐等逆境胁迫处理后的叶片相对电导率平均较对照植株低25%～30%,证明转基因植株的耐逆性有所增强.考察发现,非胁迫条件下CBF1基因的组成型超表达使转基因植株的生长受到抑制.

根癌农杆菌介导TA29-Barnase基因转化甘蓝型油菜的研究

经比较影响农杆菌介导Barnase嵌合基因转化甘蓝型油菜的各种因素后 ,建立了高效稳定的转基因实验体系。按该体系 ,甘蓝型油菜“湘油 15”子叶柄预培养 2 0h ,OD60 0 为 0 5农杆菌菌液感染后共培养 3d ,在MS +2mg·L-1AgNO3 +4 5mg·L-1BA +10mg·L-1Km +30 0mg·L-1Carb培养基上进行选择 ,转化率为 8 8% ,PCR检测和Southern杂交检测证明外源基因已整合了甘蓝型油菜基因组中。

根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究进展

根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是近年来发展的一种新方法 ,与其它方法相比 ,该方法具有操作简便、转化效率高和易得到稳定转化子等特点。目前 ,在根癌农杆菌介导下已实现了多个属种真菌的遗传转化 ,显示出良好的应用前景。综述了根癌农杆菌介导真菌遗传转化的转化机理和T DNA在真菌细胞中的存在方式等方面的研究结果 ,并展望这一方法的应用前景。

甘蔗根癌农杆菌介导转化海藻糖合酶基因获得抗渗透胁迫能力增强植株

由双拷贝CaMV35S启动子驱动担子菌灰树花 (Grifolafrondosa)的海藻糖合酶基因 (TSase)构建植物表达载体 pBBBT ,通过三亲交配法将 pBBBT导入根癌农杆菌EHA10 5菌株 ,经根癌农杆菌介导转化甘蔗 (Saccha rumhybrid)栽培品种 ,以增强甘蔗的抗旱能力。结果表明 ,甘蔗胚性愈伤组织对EHA10 5菌株敏感 ,甘蔗外植体开始大量形成胚性愈伤组织时是感染的适宜时期 ,用膦丝菌素 (PPT)筛选 ,抗性植株发生频率平均为 4 .5 %。经PCR及dot Southern检测证明 ,TSase已经整合到甘蔗基因组中。部分转化植株根叶畸形、株型异常、生长缓慢。移栽到含PEG80 0 0 17.4 % (w/v)的MS培养基后 。

根癌农杆菌介导苹果遗传转化研究进展

论述和分析了影响苹果高效离体再生的主要因素 ,包括试验材料苹果的基因型、外植体生理状态、培养基类型、植物激素、Ag NO3、前期暗培养、抗生素等内外因子 ,以及影响根癌农杆菌介导苹果遗传转化的主要因素 ,包括苹果基因型、外植体生理状态、菌株类型、菌液浓度、活化物质的应用、共培养、预培养、选择培养、培养基成分等内外因子。并对其研究现状。

根癌农杆菌介导绿色荧光蛋白基因转化印度酸桔的研究

通过根癌农杆菌介导将绿色荧光蛋白基因转入印度酸桔的胚性愈伤组织中 ,经潮霉素筛选 ,获得抗性愈伤组织 ,并再生植株。对这些植株进行GUS染色、PCR分析、绿色荧光检测和Sourthern杂交验证 ,结果表明绿色荧光蛋白已经在转基因植株中表达。

根癌农杆菌介导籼稻遗传转化影响因素研究

研究了抗生素种类、继代和菌液浓度对农杆菌介导籼稻转化的影响,并将反义蜡质基因导入4个高产、直链淀粉含量高的籼稻品种中。结果显示,羧苄青霉素的抑菌效果优于头胞霉素,其适宜浓度为250￣350mg/L;4个品种继代愈伤比初代愈伤能获得更高的抗性愈伤得率;各个品种转化有其最佳的农杆菌菌液浓度(OD600值),茉莉新占和绿黄占为1.0,粤香占和矮秀占为0.6。应用此优化的农杆菌转化体系,我们得到了转化植株;PCR扩增和Southern杂交结果证明外源基因已经整合到转基因水稻的基因组中。

根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化系统的建立

为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌根癌农杆菌介导转化(ATMT)的优化系统。这个优化系统的转化条件如下:以30μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8h,共培养20h,共培养时固体诱导培养基上的乙酰丁香酮浓度为200μmol/L,共培养温度25℃,共培养时固体诱导培养基pH5.6～5.8。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出500bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明,T-DNA已经插入到目标菌株GD118中。

根癌农杆菌介导的马铃薯转化系统的优化

以马铃薯品种PB04的叶片和茎段为外植体，对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究。分别比较不同转化条件（菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间）对马铃薯遗传转化效率的影响，以及选择压浓度和加入时间对抗性愈伤出芽的影响，结果表明：（1）在玉米素（ZT）2mg／L，萘乙酸（NAA）0．01mg／L条件下能有效地提高马铃薯愈伤组织分化率；（2）外植体经过2d的预培养，在OD600=0．8的农杆菌菌液中侵染10min后，抗性愈伤诱导率最高。（3）头孢霉素（Cef）比羧苄青霉素（Car）更适合用于马铃薯外植体的遗传转化。（4）农杆菌侵染后恢复培养5～7d再加入卡那霉素（Km）50mg／L能有效地提高外植体的转化率。

根癌农杆菌介导的香蕉高效遗传转化系统的建立

为建立根癌农杆菌介导的香蕉高效遗传转化系统,本研究以雄性花诱导产生的贡蕉胚性悬浮系为转化受体,从潮霉素筛选浓度和筛选方法两方面进行了优化。研究结果表明,贡蕉悬浮系在M2液体培养下潮霉素的适合筛选浓度为5mg/L。将液体共培养7d后的贡蕉胚性悬浮系转接到M2液体筛选培养基进行培养,每10d继代一次。GUS组织染色表明,经过3代抗性筛选的ECS几乎全为转化细胞。经过3个月的胚诱导培养获得成熟抗性体细胞胚,平均抗性体细胞胚得率为4580个/mLPCV。同时,转化苗的PCR检测结果表明,gus基因已整合到贡蕉基因组中。本研究表明液体筛选系统有利于转化胚性悬浮细胞的增殖,大大地提高了香蕉转基因的转化效率。

根癌农杆菌介导B.t.基因和CpTI基因对花椰菜的转化

用根癌农杆菌介导的方法 ,将B .t.基因和Cp TI基因分别导入花椰菜“杂交 75天”的父本和母本的无菌苗下胚轴切段细胞 ,都获得了转基因植株。经过预培养的下胚轴切段用根癌农杆菌 (LBA44 0 4/ pG BI4A2B ,含B .t .基因 ;LBA44 0 4/pBRLC ,含CpTI基因 )进行感染后 ,共培养 48h ,继续培养 30d后 ,将分化芽转移至筛选培养基上。 10d后 ,大多数分化芽的顶端变成紫色 ,2 0d后紫色芽逐渐变白死亡 ,而转化芽在选择培养基上长成小植株。小植株移至大田能正常生长、开花、结籽。PCR和Southernblot分析表明B .

根癌农杆菌介导花生高效遗传转化体系的优化

本文研究表面活性剂(MES,methyl ester sulfonate)、真空渗入法和二次侵染对提高花生转化效率的影响,建立了一种农杆菌介导的花生快速高效遗传转化体系。该体系以带子叶的胚轴为外植体,在OD600为0.7的菌液中,加入150mg/L的MES,40kPa真空处理10min,共培养3d后进行二次侵染。采用该体系可显著提高遗传转化率,GUS基因阳性表达率最高,达73.3%。

根癌农杆菌介导的水稻遗传转化

就根癌农杆菌介导水稻遗传转化的研究历程和影响农杆菌转化水稻的几个关键因素以及这一问题的前景作了评述和展望