一株链霉菌的鉴定及其产格尔德霉素的发酵工艺研究

【目的】对链霉菌Streptomyce sp.FIM18-0592进行菌种鉴定,并对其胞外格尔德霉素产量进行发酵工艺优化,旨在提高产量并降低发酵成本。【方法】通过形态特征、培养特征和生理生化特性,结合16S rDNA序列分析构建系统发育树进行菌种鉴定;采用单因素试验优化培养条件及培养基配方,进一步使用最陡爬坡试验和响应面试验优化培养基配方的含量。【结果】通过对链霉菌FIM18-0592的形态特征、培养特征及生理生化特征进行初步培养观察发现,其在ISP2等培养基上生长较好,气生菌丝旺盛,产黑色素。结合16S rDNA分子鉴定,确定该菌为格尔德霉素链霉菌(Streptomyces geldanamycininus)。通过单因素试验对发酵条件以及培养基配方进行优化,得到最适宜菌株发酵的培养条件为转速140 r/min、装液量12%(体积分数)、接种量7%(体积分数)、培养时间144 h。最佳的碳源、氮源、无机盐分别为葡萄糖、黄豆饼粉和硫酸铵。采用最陡爬坡试验和响应面优化试验确定了其最优的发酵培养基为:葡萄糖10.42%、黄豆饼粉1.68%、硫酸铵0.3%、乳酸0.3%、甘油4%、硫酸镁0.1%、碳酸钙0.4%,在此条件下,格尔德霉素的发酵效价达到2887μg/mL,较原始发酵工艺效价提高了66%。【结论】链霉菌FIM18-0592为格尔德霉素链霉菌,通过对其发酵工艺进行优化显著提高格尔德霉素的产量,为格尔德霉素及其衍生物的开发和利用奠定基础。

吸水链霉菌17997格尔德霉素部分生物合成基因簇的克隆和分析

吸水链霉菌17997(Streptomyceshy groscopicus17997)是我所从中国云南土壤中分离到的格尔德霉素(geldanamycin,GDM)产生菌,GDM具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性,但其肝毒性和水溶性差的缺点限制了其在临床上的应用。为了实现对GDM结构的生物学改造,首先要获得GDM的生物合成基因。根据GDM后修饰基因——氨甲酰基转移酶基因(gdmN)的保守序列筛选S.hygroscopicus17997的柯斯质粒基因组文库,共获得6个阳性克隆,选择CT-4阳性柯斯质粒进行亚克隆和测序,又通过PCR延伸的方法获得了与CT4连锁的将近5kb的外源序列,共获得28.356kb的外源DNA序列,其中包含了13个可能阅读框架,通过同源比较证实该序列与S.hygroscopicusNRRL3602中的GDM生物合成基因有很高的同源性。为进一步研究GDM生物合成基因的功能,并通过组合生物学的方法改造GDM的结构奠定了基础。

格尔德霉素生物合成的调控基因

从吸水链霉菌17997中克隆了格尔德霉素(Geldanamycin,Gdm)生物合成酶基因簇,通过生物信息学分析发现两个LAL(Large ATP-bindingregulators of the LuxR family)家族的调控基因gdmRI和gdmRII,基因阻断和基因回复实验证实这两个基因产物都正调控Gdm的生物合成。

格尔德霉素滴眼液在离体兔眼角膜的吸收与扩散

目的制备格尔德霉素 ( geldanamycin)滴眼液 ,进行离体兔眼角膜实验 ,检测角膜及人工房水中药物量。方法采用二室渗透池法 ,在不同时间点取人工房水及角膜 ,分别测定药物在角膜吸收量及角膜中药物扩散进入人工房水量 ,对累积数据进行方程模拟。结果药物易被角膜吸收 ,但不易渗透进入房水 ,药物在角膜中不同时间的吸收累积曲线符合Higuchi方程 ,吸收速率常数为10 2 1 9ng/h。角膜中的药物扩散进入人工房水符合零级方程 ,药物在角膜和人工房水中达到平衡的时间分别为 2h和 4h ,药物从角膜扩散进入人工房水有 2h时滞。结论格尔德霉素滴眼液易被兔眼角膜吸收 ,且在角膜中达到较高浓度 。

吸水链霉菌17997产生的4,5-双氢格尔德霉素的鉴别与检测

本文对从吸水链霉菌17997发酵提取获得的格尔德霉素精制品进行了LC-MS-MS分析,发现其中含有4,5-双氢格尔德霉素组分。对吸水链霉菌17997摇瓶发酵产物的硅胶板薄层层析分析表明,4,5-双氢格尔德霉素组分在发酵中期有积累。已知4,5-双氢格尔德霉素的抗肿瘤活性比格尔德霉素差,因而需要限制其在格尔德霉素制品中的含量。本文研究结果对以吸水链霉菌17997等为产生菌研究格尔德霉素发酵,促进4,5-双氢格尔德霉素转化为格尔德霉素以提高发酵液的品质,以及检测格尔德霉素制品中的4,5-双氢格尔德霉素组分具有实际意义。

格尔德霉素与抗肿瘤药物的协同作用(英文)

目的 研究格尔德霉素 (Geldanamycin ,GDM)对人肝癌BEL 74 0 2细胞周期的影响及顺铂和丝裂霉素C等药物联用GDM后的体外体内抗肿瘤作用。方法 用MTT法检测药物对肝癌BEL 74 0 2细胞的生长抑制作用 ;流式细胞术分析细胞周期 ;小鼠移植性肝癌 2 2模型研究药物的体内抗肿瘤作用。结果 MTT法测得GDM对BEL 74 0 2细胞的生长抑制作用IC50 为 0 2 8μmol·L-1。GDM 0 1,1 0和 10 μmol·L-1处理BEL 74 0 2细胞 ,引起S期细胞比例下降和G2 M期的明显阻断。在较低浓度 ,GDM 0 1μmol·L-1和 0 2 μmol·L-1均增强一系列化疗药物包括顺铂、丝裂霉素C、阿霉素和阿糖胞苷对BEL 74 0 2细胞的细胞毒作用。小鼠移植肝癌 2 2模型中 ,GDM 0 38mg·kg-1增强顺铂和丝裂霉素C的抗肿瘤作用。协同作用十分显著 ,CDI <0 7。结论 这些结果提示GDM作为以抑制热休克蛋白 90 (Hsp90 )

格尔德霉素对人胃癌细胞株MGC-803增殖与凋亡的影响

目的探讨格尔德霉素(geldanamycin,GA)对人胃癌细胞株MGC-803增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法采用MTT法检测GA对MGC-803细胞的增殖抑制作用;流式细胞术(FCM)测定细胞周期变化及细胞凋亡率;姬姆萨染色法观察细胞形态学改变;免疫细胞化学染色法及流式细胞术分析EphA2、survivin及Caspase-3蛋白的表达变化。结果 GA可显著抑制MGC-803细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖关系;各浓度GA可阻滞细胞于S期,诱导细胞凋亡率的升高;姬姆萨染色可见用药组细胞出现凋亡形态学改变;各浓度GA可显著抑制EphA2、survivin蛋白的表达,同时上调Caspase-3蛋白的表达。结论 GA可抑制MGC-803细胞增殖,阻滞细胞周期进程,诱导细胞凋亡,其机制可能与下调EphA2、survivin的表达,进而促进Caspase-3的表达有关。

格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid,AHBA)的生物合成基因簇,根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin,Gdm)起始单位的合成,而萘醌类的AHBA基因簇可能参与未知安莎化合物的生物合成。为提高吸水链霉菌17997菌种的Gdm发酵产量,并研究高产菌种在固体培养基上孢子的生长周期。采用基因阻断技术,将吸水链霉菌17997中的萘醌类AHBA生物合成基因簇(shnSOP)进行破坏,以获得ΔSOP菌株,从而减少对合成所需共同底物AHBA的争夺。HPLC分析结果表明ΔSOP菌株Gdm的发酵产量比原株提高185%。同时,通过孢子计数发现该菌株在固体培养基上的孢子生长经历2个周期,第2代孢子菌种的Gdm产量较高。

格尔德霉素生物合成基因功能的验证

格尔德霉素(Geldanamycin,Gdm)作为热休克蛋白90的特异性抑制剂,是非常有前景的抗肿瘤和抗病毒的药物,我们已从吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus17997)的基因文库中获得了Gdm大部分生物合成基因。为了研究主要基因的功能,选择了聚酮合酶基因(Polyketide synthase gene,pks)的第六模块、单加氧酶基因(Mono-oxygenase gene,gdmM)和氨甲酰基转移酶基因(Carbamoyltransferase gene,gdmN)3个基因作为靶点分别进行基因阻断,获得了基因同源双交换的阻断变株△pks、△gdmM和△gdmN。经HPLC检测证实这些基因的阻断变株均不产生Gdm,基因回复实验排除了基因阻断所可能造成的极性效应对其它基因表达的影响,说明所克隆的pks、gdmM和gdmN基因确实是Gdm生物合成所必需的基因。

格尔德霉素对肝细胞生长因子引起的人脑胶质瘤细胞增殖与凋亡变化的影响

目的研究格尔德霉素(GDM)对肝细胞生长因子(HGF)引起的胶质瘤细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。方法U251-MG和U87-MG细胞同步生长后,用HGF作用24h,加入不同剂量GDM(终浓度为50、250、500与1000nmol/L)再处理48h。MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期时相和细胞凋亡变化。结果与正常对照组相比,单纯HGF组其U251-MG和U87-MG细胞增殖指数显著增高(P<0.05),凋亡百分率显著降低(P<0.05);单纯GDM组这两种肿瘤细胞增殖指数显著低于正常细胞(P<0.05),凋亡细胞百分率显著高于正常组(P<0.05),且随浓度增加其增殖抑制作用逐渐增强,1000nmol/L的GDM对HGF的抑制效果最好;HGF联合不同浓度GDM组其增殖指数则显著高于单纯GDM组,凋亡细胞百分率显著低于GDM组;同时HGF联合不同浓度GDM组其细胞G0/G1期细胞表达百分率显著高于GDM组(P<0.05),而G2/M期细胞表达百分率显著低于GDM组(P<0.05)。结论GDM能抑制HGF诱导的胶质瘤细胞的增殖,并促进其凋亡,即GDM对HGF的增殖促进及凋亡抑制作用具有逆转能力。

格尔德霉素溶液光降解动力学的研究

目的:研究格尔德霉素在溶液状态下的光解动力学特征。方法:以白炽灯作为光源进行照射,用 RP-HPLC 法监测格尔德霉素残留浓度,绘制光解动力学曲线,分别按零级、一级和二级反应方程进行拟合并获得相应参数。结果:格尔德霉素光解动力学总体反应符合一级反应方程。结论:格尔德霉素在光照条件下不稳定,且随着光照强度的增加和浓度的降低,光解速度加快,半衰期(t_(1/2))缩短。

格尔德霉素通过诱导热休克蛋白反应抑制DA能神经元蛋白水解应激的研究

目的探讨格尔德霉素(geldanamycin,GA)通过诱导热休克蛋白(HSP)反应抑制α-突触核蛋白(α-syn)异常表达,加强泛素蛋白酶体降解功能的神经保护作用。方法鱼藤酮作用于NGF诱导的PC12细胞建立α-syn胞质内过表达细胞模型,MTT法检测GA不同浓度及用药时程条件下的细胞活力,应用Western blot技术及共聚焦免疫荧光双标染色观察GA预处理后细胞内HSP70和α-syn的表达。荧光分光光度计测量各组细胞内蛋白酶体水解酶活性的变化。结果MTT示GA20～300nmol·L-1预处理使细胞活力呈浓度依赖性上升,吸光度分别上升至正常的65%、76%、85%和94%(鱼藤酮组为59%,P<0·01),而GA与鱼藤酮同时给药或作用于其后20h细胞活力无明显变化。Western blot结果提示GA预处理使HSP70表达上升至正常的3倍左右。共聚焦显微镜观察显示α-syn过表达现象得以抑制,并证实两者的共定位现象。酶活性测定提示GA预处理使类胰蛋白酶,类糜蛋白酶活性明显增强,荧光指数分别上升至10·4±1·61和96·0±4·77(鱼藤酮组为7·9±0·90和82·4±3·51,P<0·05),PgH水解酶活性也轻度上升。结论格尔德霉素可诱发热休克蛋白反应,主要通过HSP70的作用抑制α-syn的异常表达,促进泛素蛋白酶体降解功能,减轻蛋白水解应激反应,发挥神经保护效应。

格尔德霉素抑制高致病性禽流感病毒增殖及其所介导炎性反应研究

对高致病性禽流感病毒感染最为有效的治疗应采用抗病毒和抗炎症的联合治疗.本试验用流感病毒H5N1感染不同细胞株(A549细胞和MDCK细胞),采用不同浓度格尔德霉素对病毒感染细胞培养物作用不同时长,检测流感病毒滴度;ELISA检测格尔德霉素作用于流感病毒H5N1感染A549细胞12 h、24 h促炎性细胞因子IFN-α、TNF-α和IL-6水平.结果显示,流感病毒H5N1感染A549细胞和MDCK细胞,格尔德霉素极显著地抑制了流感病毒H5N1在细胞培养物的增殖(P<0.01),而在病毒感染36 h和48 h,格尔德霉素并没有显著抑制流感病毒在MDCK细胞上的增殖(P>0.05).促炎性细胞因子分析结果显示,格尔德霉素在流感病毒感染A549细胞12 h和24 h均显著降低了促炎性细胞因子IFN-α、TNF-α和IL-6的分泌(P<0.05).上述实验结果显示,格尔德霉素具有抑制流感病毒H5N1增殖及其所介导的炎性反应的双重效应,为格尔德霉素成为应对流感病毒流行的备选药物提供基础科学依据.

格尔德霉素对乳腺癌细胞HSP、突变型p53和CDK4表达的影响

目的探讨格尔德霉素(geldanamycin,GA)对乳腺癌MDA-MB-435s细胞中HSP(HSP90、HSP70、HSP27)和癌蛋白(突变型p53、CDK4)表达的影响。方法采用MTT法检测GA对乳腺癌MDA-MB-435s细胞的生长抑制作用,RT-PCR检测GA作用后细胞内HSP90、HSP70、HSP27mRNA表达变化,用Western blot检测GA作用后细胞内HSP90、HSP70、HSP27、突变型p53和CDK4蛋白质表达变化。结果不同浓度GA对MDA-MB-435s细胞有生长抑制作用,呈时效量效依赖关系。400nmol/LGA处理细胞48h后,细胞内HSP90、HSP70、HSP27mRNA表达和蛋白表达均增高,以HSP70增高最明显,而突变型p53和CDK4蛋白表达明显减少。结论GA通过下调突变型p53和CDK4表达抑制乳腺癌MDA-MB-435s细胞的增殖,同时GA可诱导细胞内HSP90、HSP70和HSP27表达参与细胞应激保护。

格尔德霉素发酵工艺的优化

目的研究格尔德霉素产生菌吸水链霉菌SIPI.A.2039的发酵工艺,以提高产生菌生物合成格尔德霉素的能力。方法以本实验室保藏的吸水链霉菌SIPI.A.2039为出发菌株,从摇床转速、摇瓶装量、碳源、50L发酵罐参数等方面进行发酵工艺的优化研究。结果采用经过优化获得的发酵培养基和培养条件,发酵周期为144h时,格尔德霉素的摇瓶发酵效价可由原来的230μg/mL提高至2500μg/mL。在50L发酵罐中采用优化的溶解氧和补料工艺能够使格尔德霉素的发酵效价达到3700μg/mL,并使发酵周期比摇瓶缩短了48h。结论本实验得到的结果比国内外报道的格尔德霉素的发酵效价提高了两倍以上,该发酵工艺已经达到了产业化的要求。

格尔德霉素抗病毒作用的相关基因研究

格尔德霉素(Geldanamycin,GA)作为一种苯醌安莎霉素类抗生素,能与热休克蛋白90特异性结合,具有广谱的抗病毒作用。为了从转录水平上研究GA抗病毒的分子机制,本研究以单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex virus type1,HSV-1)为对象,在确定药物有效抗病毒作用的基础上,采用基因芯片技术分析了在HeLa细胞中病毒感染和药物处理对细胞表达谱的影响,并筛选出GA抗病毒作用的可能相关基因。同时用半定量RT-PCR方法对GA诱导上调、HSV-1诱导下调的基因(ACTG1、RAN、SOD1)以及GA诱导下调、HSV-1诱导上调的基因(HYAL1)进行了验证。研究GA抗病毒作用对细胞表达谱的影响,有利于深入理解药物的抗病毒机制。

格尔德霉素对胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响

目的:研究格尔德霉素(GDM)对肝细胞生长因子(HGF)引起的胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响。方法:选用人恶性胶质瘤细胞系U251MG和U87MG,应用HGF作用24h后,分别加入不同浓度的GDM再处理48h。MTT法检测细胞增殖及抑制,分组为:正常细胞组、HGF组、GDM组、HGF+GDM组和紫杉醇组,其中HGF为终浓度30μg.L-1,GDM为50、250、500与1000nmol.L-1,紫杉醇为60μg.L-1;RT-PCR法检测HGF及c-Met基因的表达,分组如上,GDM为1000nmol.L-1。结果:HGF作用U251MG与U87MG细胞24h后,细胞增殖率分别为0.139±0.070与0.242±0.167,而50、250、500与1000nmol.L-1GDM对U251MG和U87MG生长具有抑制作用,抑制率分别为0.029±0.028、0.027±0.017、0.312±0.084和0.339±0.047与0.116±0.069、0.222±0.191、0.269±0.056和0.276±0.031;而紫杉醇对U251MG和U87MG细胞的抑制率分别为0.075±0.062与0.071±0.044;RT-PCR结果显示,HGF组HGF与c-Met表达较正常组增加(P<0.05),而HGF+GDM组则较HGF组明显降低(P<0.05)。结论:GDM能抑制HGF诱导的胶质瘤细胞增殖,并且能从基因水平抑制其表达。

聚合物纳米微球分离纯化格尔德霉素方法研究

研究了聚合物纳米微球分离纯化格尔德霉素的方法。通过聚合物纳米微球型号、洗脱液体积分数、洗脱速度、加样量的选择,确定聚合物纳米微球分离纯化格尔德霉素工艺为:采用PS30RPC型聚合物纳米微球作为层析填料,洗脱液乙醇体积分数65%、洗脱速度6.0 mL.min-1、加样量(样品∶填料,g∶g)1∶100,此时,平均层析收率为92.5%、平均总收率为81.6%、平均成品纯度为98.7%。该分离纯化方法简便可靠,适于工业化生产。

RP-HPLC法测定格尔德霉素阴道泡腾片的含量和有关物质

目的建立高效液相色谱法测定格尔德霉素阴道泡腾片的含量和有关物质.方法C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为甲醇:水(75:25),流速1.0ml/min,检测波长304nm.结果线性范围0.72～72μg/ml,r=0.9999,高、中、低3种浓度平均回收率为:(102.9±1.15)%,(101.8±1.33)%,(102.4±2.49)%,日内精密度为0.35%～0.73%,日间精密度为0.63%～1.76%.结论该方法简便、快捷、准确.

热休克蛋白90抑制剂格尔德霉素对人肝癌BEL7404细胞株凋亡作用的研究

目的:研究热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)抑制剂格尔德霉素(geldanamycin,GA)对人肝癌细胞株BEL7404的凋亡作用,并探讨其用于肝癌治疗的可行性。方法:体外培养BEL7404细胞株,以GA作用处理;噻唑兰比色(MTT)法检测GA对BEL7404细胞株的增殖抑制作用;吖啶橙荧光染色法及Annexin V-EGFP/PI双染法、透射电镜等方法研究GA对BEL7404细胞株的凋亡作用;流式细胞仪检测BEL7404细胞株的细胞周期变化。结果:GA对BEL7404细胞株具有增殖抑制作用,呈时间剂量依赖关系;GA各剂量组作用24h凋亡率均明显高于阴性对照组(6.31±0.82)%;流式细胞仪检测各剂量组GA均可使BEL7404细胞株细胞周期阻滞于G0/G1期。结论:抑制HSP90的功能可引起肝癌细胞增殖抑制和凋亡,HSP90有可能成为肝癌治疗的新靶点。