新生隐球菌格鲁比变种国内菌株的多位点微卫星灶分型

目的应用多位点微卫星灶分型(MLMT)对国内6个城市分离出的新生隐球菌格鲁比变种(Cryptococcus neo-formans var.grubii)进行基因分型,了解该变种的国内基因型分布特征。方法提取已鉴定的43株新生隐球菌格鲁比变种DNA,用PCR对3个微卫星位点(CNG1,CNG2,CNG3)的基因片段进行扩增后测序。再计算每一菌株位点基序重复数(CNG1对应TA重复,CNG2对应GA重复,CNG3对应CAT重复);据基序重复数判定各菌株的基因型。结果所有43株菌中,MLMT-17型占83.72%,该型在临床和环境的菌株中分别占86.67%和70%。MLMT-39、-40是新发现的基因型。结论在我国,MLMT-17是最常见的新生隐球菌格鲁比变种基因型,普遍存在于临床和环境菌株中,表明国内临床新生隐球菌病的感染菌株主要源于本土环境菌株。

中国和巴西临床新生隐球菌格鲁比变种菌株的种群和基因型比较分析

目的了解新生隐球菌格鲁比变种(Cryptococcus neoformans var.grubii)临床菌株在国内和巴西多位点微卫星位点定型(multilocus microsatellite typing MLMT)的种群分布特征,探讨并分析两国新生隐球菌格鲁比变种MLMT基因型差异。方法对已鉴定的69株新生隐球菌格鲁比变种进行DNA提取,采用3个微卫星位点(CNG1、CNG2、CNG3)的正反序列引物对相应的微卫星位点基因片段进行扩增后测序;测序后计算出每一菌株位点基序重复数(CNG1对应TA重复,CNG2对应GA重复,CNG3对应CAT重复);结合不同基序重复数判定各菌株的基因型。应用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。结果在33株被MLMT基因分型的国内新生隐球菌grubii变种菌株中有5种基因型被鉴定,其中29株为MLMT-17,占87.88%;而在36株巴西临床菌株中有10种基因型被鉴定,其中19株为MLMT-13,占52.78%。结论两国间新生隐球菌格鲁比变种临床菌株的主要基因型分布存在显著差异。巴西临床菌株的基因型分布表现为多样性。

新生隐球菌格鲁比变种临床株与环境株微卫星基因型的小鼠毒力实验研究

目的了解巴西新生隐球菌格鲁比变种（C.neoformans var．grubii）多位点微卫星定型（ multilocus microsatllite typing, MLMT）在临床和环境中的分布特点，探讨不同微卫星型的新生隐球菌格鲁比变种临床株和环境株的毒力差异。方法根据多位点微卫星分型技术对分离自巴西的40株（17株临床株和23株环境株）新生隐球菌格鲁比变种进行分型，筛选出临床株及环境株中分布占优势的菌株，应用小鼠毒力试验分别对其进行毒力检测，通过发病情况及病理切片比较毒力差异。结果40株格鲁比变种共鉴定出11种微卫星型，临床株中的优势菌株为MLMT-13型，共9株，占临床株的52．9％（9／17），环境株中的优势菌株为MLMT－36型，共10株，占环境株的43．5％（10／23）；小鼠毒力试验结果显示MLMT－13型感染小鼠后发病率为100％，而MLMT－36型发病率为7．5％，且病理结果也存在明显差异。结论格鲁比变种在从环境迁徙到宿主的过程中，毒力随环境的变化发生了改变，该变化也可在其微卫星重复序列上体现出来。该实验证明新生隐球菌格鲁比变种的分布及来源与微卫星型之间存在相关性，临床株MLMT-13型和环境株MLMT－36型之间存在着显著毒力差异。

云南省部分地区鸽粪中新型隐球菌格鲁比变种微卫星分型分析

目的对云南部分地区鸽粪分离株新型隐球菌进行多位点微卫星位点(multilocus microsatellite typing,MLMT)分型,了解其种群分布特征。方法对分离自云南省部分地区鸽粪中的152株新型隐球菌提取DNA,分别以CNG1、CNG2、CNG3为引物进行PCR扩增并测序,计算每一菌株CNG1中TA、CNG2中GA以及CNG3中CAT的重复数,结合不同基序重复数进行MLMT分型。结果采用MLMT法将大理、昭通、曲靖和临沧地区鸽粪分离株新型隐球菌格鲁比变种分为6个基因型,其中MLMT-17型占91.45%,为主要基因型;MLMT-26、29、34、39、40型分别占0.66%、1.97%、0.66%、0.66%和4.60%。结论 MLMT-17是云南省部分地区鸽粪新型隐球菌格鲁比变种中最常见的基因型。

华东地区新生隐球菌药物敏感性分析

目的探索近年来华东地区分离的新生隐球菌临床株对常用抗真菌药物的体外敏感性。方法采用美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的M27-A3肉汤微量稀释法检测氟康唑、氟胞嘧啶、两性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑对新生隐球菌临床分离株的最低抑菌浓度（MIC）范围,并通过内转录间隔区（ITS）测序法对检测出的耐药和剂量依赖性敏感（SDD）菌株进行进一步鉴定。结果抗真菌药物对96株新生隐球菌的MIC90（MIC范围）为：氟康唑4（0.5~16）μg/m L,氟胞嘧啶4（0.25~64）μg/m L,两性霉素B 0.5（0.03~1）μg/m L,伊曲康唑0.5（0.03~1）μg/m L,伏立康唑0.25（0.03~0.5）μg/m L,所有耐药菌株及SDD菌株的分子鉴定均为新生隐球菌格鲁比变种。结论除伊曲康唑外,华东地区新生隐球菌临床株对抗真菌药物的敏感性高,耐药菌株少,不敏感株以新生隐球菌格鲁比变种为主。

新生隐球菌毒力差异菌株的全基因组测序及毒力相关基因的筛选

目的了解及分析新生隐球菌格鲁比变种（Cryptococcus neoformans var grubii）两组毒力差异明显的多位点微卫星型（multilocus microsatellite typing，MLMT）菌株的全基因组序列，筛选出引起其毒力差异的相关基因。方法选取毒力差异最为明显的不同基因型菌株各1株进行全基因组重测序，运用比较基因组学方法全面分析测序结果，使用非同义SNPs（non-synonymous SNPs，nsSNPs）、无义突变SNPs、产生移码突变InDels的策略广泛筛选差异基因。对筛选出的基因在所有实验菌株中进行DNA测序验证，并提取总RNA，采用快速扩增5’和3’cDNA末端（rapidamplificationof5’and3’cDNAends，RACE）技术，克隆后测序获得对应基因的完整cDNA全长序列信息。结果通过全基因组重测序，环境株IFM56731和临床株IFM56800均分别获得127倍和111倍覆盖率的有效数据。分别对SNPs和InDels数据进行统计分析，应用无义突变SNPs和产生移码突变的InDel分别筛选出3个差异基因。对筛选出的6个基因在所有实验菌株中进行扩增测序，并对其中3个基因进行cDNA的测序分析，最终确定基因CNAG_01032的转录序列位置和结构，并验证了预测的无义突变位点存在于实际的mRNA中。结论本研究通过全基因重测序数据分析证明，应用无义突变SNPs和产生移码突变的InDels进行差异基因筛选的策略具有较好针对性，并筛选出6个潜在与毒力相关的基因，通过对所有实验菌株的测序和对全长cDNA的测序验证，最终筛选出基因CNAG一01032为可能引起菌株毒力差异的基因。

新生隐球菌毒力差异基因型菌株间部分毒力相关基因分析

目的：了解新生隐球菌格鲁比变种（ Cryptococcus neoformans var． grubii）两组毒力差异明显的多位点微卫星型（ multilocus microsatellite typing ， MLMT ）菌株间的差异基因，探讨导致新生隐球菌格鲁比变种间毒力差异的相关基因及这些基因的功能。方法根据已有基因组数据，针对可能为新生隐球菌毒力相关的基因设计特异性引物，扩增并测序，通过序列对比分析每个基因在两组微卫星基因型菌株间存在的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms ，SNPs）位点，并对引起差异的蛋白质进行分析和预测。结果在成功测序的11个基因中，除2个基因序列完全相同外，其余9个基因在两组毒力差异明显的基因型菌株间分别存在1～4个规律性SNPs，其中，有2个基因中存在非同义SNPs（ non-synonymous SNPs ，nsSNPs ），这2个基因的编码产物分别为沉默信息调节因子2家族成员HST302和UV切除修复蛋白RAD23。另外，在对RAD23蛋白的系统发育分析发现，与真菌界的其他门类相比，在担子菌纲的多数RAD23蛋白与人类的同源基因亲缘关系更近。结论本研究发现了新生隐球菌两种毒力差异明显的微卫星基因型菌株间具有重要功能的两个差异基因（ Rad23和Hst302），且经预测nsSNPs对蛋白结构和功能均有一定影响，而蛋白的具体功能有待通过各项试验进一步深入研究。