桑椹胚移植在体外受精-胚胎移植中的临床应用

目的:探讨新鲜周期day4(D4)桑椹胚移植的可行性和移植策略。方法:回顾分析2013年1月至2021年12月在河北医科大学第二医院生殖医学中心行IVF/ICSI-ET的day3(D3)和D4新鲜周期移植患者的临床资料。D4桑椹胚移植205周期,采用倾向性评分(PSM)1∶4匹配,D3移植组820周期,比较两组总的临床妊娠率、胚胎种植率、流产率、活产率及出生缺陷情况。比较D4移植双胚、单胚不同评级桑椹胚患者妊娠结局。比较D41~2级单桑椹胚移植和D5/D6单囊胚移植患者妊娠结局。结果:D3、D4移植两组患者的临床妊娠率、种植率、多胎率、异位妊娠率、流产率、活产率以及出生缺陷率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。按D4移植的桑椹胚评级分组,移植1~2级桑椹胚组的种植率显著高于移植3级桑椹胚组患者,差异有统计学意义(P<0.05)。D4移植一枚1~2级桑椹胚患者与D5/D6单囊胚移植患者的临床妊娠率和活产率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:D4桑椹胚移植的策略是可行的,其增加了胚胎选择方案,是移植策略的有效补充;优质的单桑椹胚胎移植在保证较好的临床妊娠率和活产率的前提下降低多胎率;桑椹胚移植既对胚胎进行了优选又缩短了胚胎在体外的培养时间。

小鼠桑椹胚简易玻璃化冷冻技术再探讨

本试验继小鼠扩张囊胚玻璃化冷冻保存成功后，在室温（２５℃）下利用不同浓度的ＥＦＳ玻璃化溶液，对小鼠的桑椹胚简易玻璃化冷冻技术进行再探讨。结果是胚胎在１０％ＥＧ溶液中预先处理５分钟，再移入事先配置好含有ＥＦＳ３０的０．２５ｍｌ塑料细管中１分钟平衡后直接投入液氮中冷冻，解冻后获得的发育率最高（９４％）。冻胚移植后妊娠率和产仔率分别为５６％（９／１６）及４２％（４９／１１６）。与对照组相比差异不显著（Ｐ＞０．０５）

家兔桑椹胚和早期囊胚在饲养层表面的贴壁行为

探讨了不同状态家兔３日龄桑椹胚和４日龄囊胚在饲养层上的贴壁规律。结果表明，去除或保留透明带和胶膜的全胚贴壁最晚，离散胚在培养２４ｈ内即可贴壁，切割胚贴壁大多数发生于体外培养２４～４８ｈ之间。离散胚和切割胚都可能在培养１２ｈ后重新聚集成中空的亚囊胚结构。亚囊胚的贴壁过程是某一部位首先附着于饲养层表面，然后滋胚层铺展形成向下的拉力，使其全部贴壁。

小鼠桑椹胚玻璃化冷冻前后生物频谱处理对体外发育的影响

本试验利用周林频谱仪（WS－302）照射玻璃化冷冻前后小鼠桑椹胚，研究对其体外发育的影响，结果表明：胚胎在10％EG溶液中处理5min后移入EFS30中处理1min的二步法冷冻组，解冻后经照射5～20min后的胚胎发育率（95％～100％）与对照组（94％）比较无显著性差异（P＞0．05）。当在EFS40中处理1min的一步法冷冻组的胚胎，照射后发育率由对照组的54％提高到97％差异极显著（P＜0.01）。改用GFS40一步法冷冻的胚胎照射后的发育率也明显高于对照组（P＜0．05）。另外，对冷冻前胚胎进行照射，其解冻后发育率（87％）也得到了显著提高（P＜0．01）。

FDA-PI荧光双色法快速评价小鼠桑椹胚活力

胚胎移植成功与否关键取决于胚胎的存活力和发育能力,但是胚胎的存活力很难预知。本实验以小鼠桑椹胚为材料,研究荧光物质二乙酰荧光素(Fluorescein diacetate,FDA)-碘化丙啶(Propidium iodide,PI)在胚胎活力检测上的应用,同时检测两种荧光物质FDA和PI对小鼠桑椹胚的毒负作用,再通过胚胎移植来最终证明荧光标记的可靠性。实验结果表明,荧光物质FDA和PI能分别标记强活力胚胎、弱活力胚胎和死胚胎,且FDA对胚胎无毒负作用,PI对透明带完整的胚胎也无毒负作用,所以FDA-PI荧光双色法是一种简捷、安全而有效的的小鼠胚胎活力评价方法。

不同冷冻和解冻方法对小鼠桑椹胚发育的影响

本试验以2种程序化冷冻液和2种玻璃化冷冻液对昆明白系小鼠的桑椹胚进行细管法冷冻保存,比较程序化冷冻-管外解冻和玻璃化冷冻-管内解冻对胚胎体内、外发育的影响。胚胎体外培养结果表明:玻璃化冷冻组及程序化冷冻组胚胎发育率(95.3%￣95.8%,98.9%)无显著(P>0.05)差异。将程序化冷冻、EFS30玻璃化冷冻以及新鲜的胚胎各168枚移植给假孕受体鼠,妊娠受体产活仔率各组间相比(50.8%,58.3%,54.9%)无显著性(P>0.05)差异。结果证明,玻璃化冷冻保存的胚胎管内解冻效果好,为生产中家畜的胚胎移植提供了理论和技术参考。

甘油蔗糖液对哺乳动物桑椹胚的渗透反应及冻存效果研究

为了提供快速冷冻前胚胎发生部分脱水的科学依据，我们观察了家兔桑椹胚在冷冻保护液中的体积变化。当桑椹胚置于仅含３．０ｍｏｌ／Ｌ或４．０ｍｏｌ／Ｌ甘油液中，桑椹胚立即皱缩，２ｍｉｎ时体积为等渗时体积的５８．９％或５９．６％，１０ｍｉｎ时桑椹胚体积达到等渗时的９０．８％或７６．９％，将这些桑椹胚接着移入含３．０ｍｏｌ／Ｌ或４．０ｍｏｌ／Ｌ甘油加０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖保护液中，桑椹胚再次发生皱缩及膨大变化，１０ｍｉｎ后，桑椹胚体积为等渗体积的８０．８％或８１．９％。在这种脱水状态下将桑椹胚进行超快速冻存，解冻后有７３．６８％或８０．５６％在体外发育至囊胚。将经３．０ｍｏｌ／Ｌ甘油及３．０ｍｏｌ／Ｌ甘油加０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖预处理的小鼠桑椹胚超快速冻存后，有９４．１％可在体外发育。结果表明：冷冻前桑椹胚的脱水状态有助于超快速冻存的成功进行。

重组人白细胞介素-1β对小鼠玻璃化冷冻桑椹胚体外生长发育和移植存活率影响的研究

研究探讨了重组人白细胞介素 -1 β(rh IL-1 β)对小鼠玻璃化冷冻桑椹胚体外生长发育和移植存活率的影响作用 .结果表明 :培养液中重组人白细胞介素 -1β浓度为 5 0 IU/m L时 ,对小鼠玻璃化冷冻胚胎的体外生长发育无明显的影响 ,当浓度为 5 ,5 0 0 ,5 0 0 0 IU/m L时 ,对胚胎的生长发育具有明显的抑制作用 ;小鼠玻璃化冷冻胚胎解冻后 ,经过 5 ,5 ,5 0 ,5 0 0 IU/m L重组人白细胞介素 -1 β,3 -4h的短期处理后 ,胚胎妊娠率明显提高 ,其中 5 0 IU/m L处理组 (1 0 0 % )与对照组 (5 6.2 5 % )相比差异显著 (P<0 .0 5 ) ,而 5 0 0 0 IU/m L处理组 (3 3 .3 3 % )的胚胎妊娠率明显降低 ,与对照组 (5 6.2 5 % )相比差异显著 (P<0 .0 5 ) .本研究表明 5 0 IU/m L重组人白细胞介素 -1 β的短期处理可能提高母体对冷冻胚胎的接受能力 .高浓度重组人白细胞介素

乙二醇为主体的玻璃化溶液对小鼠桑椹胚的超低温保存

本试验系统地研究了以低毒性的乙二醇为主体，添加葡聚糖和海藻配制成的玻璃化溶液（EDT20，EDT30及EDT40），在室温（20 ℃或25 ℃）下对小鼠体内受精的桑椹胚进行玻璃化冷冻保存。毒性试验表明，30%葡聚糖溶液（D）,0.5mol/L海藻糖溶液（T），以及两种物质的混合液即DT溶液，对胚胎均无化学毒性作用，乙二醇是化学毒性的主要来源。且随着乙二醇浓度的增加和平衡时间的延长，对胚胎的化学毒性也增大。小鼠桑椹胚的玻璃化冷冻试验中，20 ℃室温下胚胎冷冻效果好于25 ℃，但差异无显著意义（P>0.05）。在20℃室温下,胚胎于EDT30中平衡1 min,后直接投入液氮中一步法冷冻后胚胎体外发育率、移植妊娠率和产仔率分别为94.00%、45.00%、38.00%，与对照组差异均无显著意义（P>0.05）。若将胚胎在10%EG中平衡5 min，再移入EDT30中平衡30 s二步法冷冻效果最佳，解冻后囊胚发育率、移植妊娠率和产仔率分别为96.00%、57.00%、52.00%,与对照组差异均无显著意义(P>0.05)。

重组人白细胞介素-1β对冷冻后小鼠桑椹胚体内外发育率的影响

本试验探讨了重组人白细胞介素－１β（ｒｈＩＬ－１β）对小鼠桑椹胚玻璃化冷冻后体内外发育的影响。结果表明：当ｒｈＩＬ－１β添加浓度为５、５０、５００ＩＵ／ｍｌ时，对解冻后的胚胎经体外培养，发育率（８７％～１００％）与对照组（９４％）相比无显著性差异（Ｐ＞００５）。而浓度提高到１０００ＩＵ／ｍｌ时，胚胎的发育受到抑制。解冻后胚胎在含有５、５０、５００ＩＵ／ｍｌ浓度的ｒｈＩＬ－１β培养液中培养３～４ｈ后移植于假妊娠３ｄ的受体鼠，移植妊娠率（８６％、１００％、８３％）高于对照组（５６％），特别是５０ＩＵ／ｍｌ处理组与对照组有极显著差异（Ｐ＜００１）。而浓度为１０００ＩＵ／ｍｌ处理组的胚胎移植妊娠率（３０％）低于对照组。试验证明，添加浓度为５～５００ＩＵ／ｍｌｒｈＩＬ－１β的培养液，对解冻后胚胎的体外发育率无影响，而且能够显著提高移植妊娠率。

兔桑椹胚胎细胞周期同步化及核移植后的发育能力

进一步改进兔供体桑椹胚G_1期可逆性同步化方法,并比较G_1期核移植胚胎和未同步化核移植胚胎在体内的发育能力。将兔早期16细胞胚用秋水仙胺和aphidicolin处理适当时间,这时期胚胎细胞处于32细胞期的G_1期。经扫描显微分光光度法测定表明,没有DNA合成。经两种药物同步化处理,胚胎正常细胞周期、分裂及移植前发育均不受影响。与用未同步化32细胞胚细胞核移植相比,用同步在G_1期胚胎细胞进行核移植后,显微操作胚融合、激活及分裂均无明显变化,移植到受体内的发育能力明显改善。

两种玻璃化液冻存小鼠桑椹胚的研究

目的:研究EDS-40和EFS-40两种玻璃化溶液对小鼠桑椹胚冻存的影响。方法:随机选用NIH小鼠优质桑椹胚,先对两种玻璃化溶液EDS-40(40%乙二醇+18%葡聚糖+0.5mol蔗糖)和EFS-40(40%乙二醇+18%聚蔗糖+0.5mol蔗糖)行毒性测试:再在20℃±5℃室温下,将小鼠桑椹胚分别加入到两种玻璃化溶液,玻璃化后装管并迅速投入液氮中,冻存2-3个月。各组均在25℃的水浴中复温,胚胎用解冻液(S-PBS)和培养液反复洗涤后移入含Ham'sF12培养液培养48h,观察胚胎形态及发育。部分胚胎体外培养12-14h后行胚胎移植,观察妊娠及产仔情况。结果:两种玻璃化溶液的毒性有显著性差异,EDS-40较EFS-40毒性低(X2=6.415,P<0.05),透明带完好率两组间无显著性差异(X2=2.189,P>0.05)。胚胎优良率(X2=7.51,P<0.01)和发育率(X2=5.556,P<0.05)EDS-40较EFS-40更好,两组间妊娠率(X2=1.937,P>0.05)及产仔率(X2=0.245,P>0.05)无显著性差异。结论:EDS-40较EFS-40玻璃化溶液毒性低,冻存胚胎效果更好。

冻融卵裂期优质胚胎过夜培养后形成桑椹胚对临床妊娠结局的影响

目的探讨冻融卵裂期优质胚胎过夜培养后形成桑椹胚对临床妊娠结局的影响。方法回顾性分析2014年1月至2019年12月在本中心行冷冻复苏双胚胎移植的311个周期。根据过夜培养后胚胎卵裂球是否分裂生长分为2组:A组(生长组,n=275)和B组(未生长组,n=36);并根据冻融优质胚胎过夜培养后是否发育成桑椹胚以及达到桑椹胚的胚胎个数将A组分为A0组(均未发育为桑椹胚,n=82)、A1组(1枚胚胎达到桑椹胚,n=105)和A2组(2枚胚胎均达到桑椹胚,n=88)。比较各组移植后的临床妊娠结局。结果纳入的311个周期中,临床妊娠周期数为177个,临床妊娠率56.9%。A组的胚胎种植率(40.7%vs.20.8%)、临床妊娠率(59.6%vs.36.1%)以及活产率(50.2%vs.30.6%)均显著高于B组(P<0.05)。亚组分析中,相较于无桑椹胚形成的A0组,A1组和A2组胚胎种植率(41.9%,51.7%vs.27.4%)、临床妊娠率(61.0%,70.5%vs.46.3%)、多胎妊娠率(37.5%,46.8%vs.18.4%)以及活产率(52.4%,59.1%vs.37.8%)均显著升高(P<0.05);A2组多胎妊娠率高于A1组(46.8%vs.37.5%),但无显著差异(P>0.05);3个亚组间流产率、早期流产率以及早产率均无显著性差异(P>0.05)。结论冻融卵裂期优质胚胎过夜培养后发育为桑椹胚,预示有更好的临床妊娠结局;复苏2枚冻融优质胚胎过夜培养后均发育为桑椹胚者,可以考虑选择性单胚胎移植,以减少多胎妊娠发生。

室温条件下保存的小鼠桑椹胚的生存性

为了开发哺乳动物胚胎的室温保存液 ,在室温 ( 2 0℃ )条件下 ,用磷酸缓冲型 PB1、HEPES缓冲型 M2及重碳酸缓冲型 m KRB等 3种溶液及其修正液 ,保存小鼠桑椹胚 4 8h或 72 h,然后经体外培养 ,观察其发育至扩大囊胚的能力。结果 ,用 M2液保存的小鼠桑椹胚获得比较高的囊胚率 ;从 M2液中除去 Na H2 PO4、Na HCO3及葡萄糖 3种成分保存的小鼠桑椹胚 ,发育至扩大囊胚的能力显著提高 ;从溶液中除去丙酮酸钠和乳酸钠 ,或者添加 EDTA和谷氨酰胺 ,对保存后的桑椹胚发育至扩大囊胚能力无显著影响 ;而在保存液中添加犊牛血清后 ,小鼠胚胎的发育能力反而下降。结果表明 ,在室温条件下 ,不含 Na H2 PO4、Na HCO3及葡萄糖 3种成分的 M2液 。

小鼠受精卵在体内外发育成桑椹胚的对比研究

用１０ 单位孕马血清和１０ 单位人绒毛膜促性腺素使小白鼠超数排卵，自然交配后分两组，一组取受精卵，统计受精卵个数，并在ＣＺＢ 培养基微滴内培养７８ｈ，统计发育成桑椹胚的个数。另一组，让受精卵在体内自然发育７２ｈ，收集桑椹胚，统计其个数。比较研究受精卵在体内外发育到桑椹胚的能力。实验结果表明，每只鼠的平均冲出受精卵数为２８．２ 枚；受精卵在体外培养时桑椹胚的发育率为８８％ ；因此在体外培养时从每只鼠平均可得２５ 枚桑椹胚；受精卵在体内发育时每只鼠的平均冲出桑椹胚个数为７ ．２ 枚。比较两组实验结果发现，从前者得到桑椹胚的个数比后者多２ 倍。另外，通过研究，提出了克服小鼠胚胎２ 细胞阻断的经验。

FDA-PI荧光双色法快速检测小鼠桑椹胚活力

本文建立了应用FDA和PI两种荧光物质评价小鼠桑葚胚活力的新方法,此方法简单、可靠。可准确鉴别小鼠桑葚胚活力的强、弱,及胚胎凋亡和死亡。也为客观评价其它动物胚胎活力提供科学依据。

超低温冷冻对小鼠桑椹胚多能性因子Oct-4表达的影响

本实验旨在探讨昆明白小鼠桑椹胚超低温冷冻后Oct-4表达的变化与胚胎发育潜力的关系。胚胎采用OPS法冷冻，即胚胎于IO％EG＋10％DMSO溶液中预处理30s，然后再移入玻璃化溶液（EDFS30）中处理25S，以OPS为承载器投入液氮中。毒性组胚胎未投入液氮，其他过程与冷冻组相同，新鲜胚胎为对照组。

兔超排及SPF桑椹胚超低温保存的研究

采用EFS40、EFS20、mEFS40、mEFS20冷冻液对供试兔桑椹胚的冷冻保存进行了探索,旨在提高冷冻胚胎的复苏率。选取三个方案进行试验。结果表明:三个方案的复苏率分别为17.1%、69.6%和36.1%。孵化率分别为12.9%、60.9%、18.4%,方案二的复苏率和孵化率显著高于方案一、三(P<0.05),通过显微镜观测也证实方案二的冷冻胚胎的形态恢复良好。试验证明使用方案二对供试兔胚胎冷冻可以保持较高的复苏率。

小鼠早期桑椹胚和致密桑椹胚玻璃化冷冻保存试验

超排处理 152只昆明小白鼠 ,把出现阴道栓的 10 1只小白鼠进行冲卵 ,得到 932枚胚胎。在室温 (2 2℃ )下 ,利用不同浓度的EFS玻璃化液 ,从中选用 4 6 5枚桑椹胚进行一步法冷冻 ,选用4 0 1枚桑椹胚进行两步法冷冻。结果是胚胎在 10 %EG(乙二醇 )溶液中预先处理 5分钟 ,再移入事先配置好含有EFS30的 0 .2 5ml塑料细管中 ,平衡 2分种后直接投入液氮中冷冻 ,胚胎解冻后获得的发育率最高 (97.3% )。致密桑椹胚的发育率比早期桑椹胚好。两步法与一步法玻璃化冷冻保存相比差异不显著 (P >0 .0 5)。