桑源阴沟肠杆菌LAMP检测方法的建立和应用

桑源阴沟肠杆菌是引起桑树发生枯萎症状的重要病原之一。对桑源阴沟肠杆菌全基因组序列进行分析,得到桑源阴沟肠杆菌特异基因序列,并以该特异基因序列为靶序列,设计筛选合适的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物组,通过荧光扩增曲线法、PCR产物琼脂糖凝胶电泳法及PCR产物SYBR Green Ⅰ染色法3种判定方法优化反应体系,进而建立桑源阴沟肠杆菌LAMP检测技术和产品。采用Yt4引物组,在60℃、外内引物浓度比为1∶10的最优反应条件下,桑源阴沟肠杆菌阳性质粒检测灵敏度为25×10^6拷贝/μL。在特异性实验中,桑源阴沟肠杆菌菌株的阳性反应能产生S型荧光扩增曲线,电泳法可得到梯形条带,染色法反应液变为绿色,而在其他供试菌株及阴性对照中均未发生这些现象。应用建立的LAMP检测法和普通PCR方法分别对来自4个不同地区的11个桑树枯萎症状样品进行同步平行检测,2种方法的检测结果一致,但LAMP检测法更简单、快捷和灵敏。建立的桑源阴沟肠杆菌LAMP检测方法,为桑源阴沟肠杆菌的快速检测及桑树枯萎病的诊断提供了新技术。