RP-HPLC测定桑叶、桑枝和桑花中槲皮素和山奈酚的含量

目的:建立 HPLC 法测定桑叶及桑枝、桑花中的槲皮素和山奈酚含量。方法:先用甲醇-25%盐酸(4:1)混合液水解桑叶、桑枝及桑花中的黄酮类成分成槲皮素和山奈酚,并采用 HPLE 法测定槲皮素和山奈酚含量。色谱柱 Shim-ODS(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液(70:30);流速为1 mL·min^(-1);检测波长为368 nm。结果:槲皮素和山奈酚的线性范围分别为0.025～0.15μg(r=0.9999),0.05～0.3μg(r=0.9998),平均回收率分别为96.2%及95.3%。5月份桑叶中槲皮素和山奈酚含量较高,桑花中山奈酚含量较高,8月桑叶中槲皮素和山奈酚含量较低。结论:此法简单、重现性好,可用于桑叶、桑枝及桑花中槲皮素和山奈酚含量的测定。

桑花叶萎缩类病毒的检测与序列多态性分析

为调查桑花叶萎缩类病毒的多态性,通过RT-PCR技术分离了安康地区桑花叶型萎缩类病毒,并对其基因组进行了克隆测序和序列分析。结果获得4个MMDVd变体,核苷酸长度为356 nt或357 nt,GC含量均约51%,Mfold网站预测二级结构两端为分枝状结构,其中约有58%的碱基配对。

桑花叶型萎缩病病原研究初报

通过往返双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(Return-PAGE)和垂直双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)检测,发现从桑花叶型萎缩病的病叶组织中提取的总核酸中存在环状小分子RNA,即类病毒RNA。根据桑花叶型萎缩病的症状和发生规律以及植物类病毒病的定义,认为这种环状小分子RNA可能是引起桑花叶型萎缩病的病原。

桑花叶卷叶病相关病毒外壳蛋白基因的原核表达与免疫检测

桑花叶卷叶病相关病毒(mulberry mosaic leaf roll-associated virus,MMLRa V)是从发生桑花叶卷叶病的桑树植株中分离的一种线虫传多面体病毒属(Nepovirus)病毒,推测其外壳蛋白的分子质量约59 k D。以感染MMLRa V的桑树叶片的c DNA为模板,采用RT-PCR获得编码该病毒外壳蛋白C端38 k D的核苷酸序列片段,暂命名为CP38。将CP38连接到原核表达载体构建重组表达载体p GEX-4T-CP38,转化大肠杆菌BL21(DE3)并经1 mmol/L IPTG诱导,使融合蛋白GST-CP38高效表达。通过SDS-PAGE胶回收原核表达的融合蛋白,以其为抗原免疫新西兰大白兔制备MMLRa V的多克隆抗血清,采用间接ELISA法测定该抗血清的效价为1∶2 048,Western blot检测其能够与MMLRa V发生特异性反应。用制备的抗血清对感病桑树叶片粗汁液煮沸后离心获得的上清液进行间接ELISA检测,MMLRa V的检出率达到84%,可以应用于大田病样的检测。

桑花叶型萎缩病相关病毒的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法

【目的】建立桑花叶型萎缩病相关病毒(Mulberry Mosaic Dwarf associated Virus,MMDaV)的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】以MMDaV保守的外壳蛋白基因为靶基因,设计特异引物,构建外壳蛋白基因序列的阳性质粒,建立阳性质粒的标准曲线,并对MMDaV特异引物的灵敏性和特异性进行检测,并使用建立的MMDaV实时荧光定量PCR检测方法检测广东、广西、海南、重庆、陕西和江西6个省区的桑病叶样品。【结果】构建的标准曲线具有良好的扩增效率(97.88%),设计的特异引物可特异的检测到MMDaV,最低的质粒检测浓度为8 copies/μL,是普通PCR灵敏度的24倍,并且MMDaV实时荧光定量PCR检测方法对6个省区的桑病叶样品均有良好的检测结果,检测的Cq值在9.69~26.17之间。【结论】建立的MMDaV实时荧光定量PCR检测方法具有高效率、特异性好和灵敏度高等特性,可被应用于寄主体内MMDaV的定量检测。

桑花叶型萎缩病病原的检测与序列分析

旨在获得安康地区桑花叶萎缩病病原序列,为桑花叶萎缩病的防治提供更多的信息。用RT-PCR技术对安康地区染花叶型萎缩病病株的病原进行了分离,克隆测序并在Mfold网站预测其二级结构。该病的病原为桑花叶萎缩类病毒MMDVd-201110151(GenBank登录号:JQ809700),核苷酸长度357bp,GC含量50.7%,219bp后38个碱基与樱桃小圆形类病毒样核糖核酸具有约85%的一致性。Mfold网站预测二级结构有58.3%的碱基配对,两端为分枝状结构。成功分离到安康地区桑花叶型萎缩病病原。

切割桑花叶萎缩类病毒的12串联体核酶基因克隆与转录载体构建

通过人工合成和PCR扩增,克隆特异性切割桑花叶萎缩类病毒RNA的12串联体核酶基因,用于控制病毒基因的表达。将桑花叶萎缩类病毒正链RNA上10 nt的靶序列连接在锤头型核酶催化区3'端,构成具有自切割功能的核酶基因。克隆该核酶基因并将其连接于载体pMD18T-SP6。在SP6 RNA聚合酶的作用下对线性化的重组质粒进行体外转录,体外自切割反应显示转录的多体自切割核酶可以通过内部的顺式切割释放出核酶分子。同时,将该12串联体核酶基因导入双元质粒pBI121中,获得重组植物转录载体pBI121-12MRz,为进一步培育抗桑花叶型萎缩病的转基因桑树奠定了基础。

桑花叶型萎缩病夏季嫁接的传染性试验

桑花叶型萎缩病又名萎缩病、癃桑、瘌头皮桑、惊桑,是一种危害十分严重的桑树全株性病害,分布于浙江、江苏、安徽、四川等省蚕区.在春末夏初和秋期22～28℃气温下发生病害,夏季高温(30℃)时出现高温隐症,同一枝条有间歇发病的现象,即春末夏初表现病症后,夏季生长部分生长正常秋季又出现病症.

桑花蜂蜜的生产及其品质分析

桑树是多年生木本种子植物,有着重要的经济价值。桑树的花结构独特,数量多,花期较长,泌蜜量大,可以作为蜜蜂的一种蜜源,从而酿造蜂蜜。基于此,对桑花蜂蜜的糖分、蛋白含量和淀粉酶值等理化指标进行了测定,还原糖含量达80.32%,转化糖为79.26%,属优质蜂蜜。利用桑花生产蜂蜜,不仅拓展了中国传统蚕桑产业的新思路,还为优质蜂蜜生产提供了新的蜜源。

桑花叶型萎缩病的研究现状与展望

桑花叶型萎缩病是危害十分严重的种苗传染性桑树病害,在我国浙江、安徽、江苏、湖南、湖北、河南、四川、重庆、广东、广西等省(市)均有发生为害,浙江省的湖州、嘉兴地区受害特别严重.发病面积约占全国桑园总面积的15%,桑树株发病率在20%～30%左右,发病严重的桑园可达到60%～80%,个别田块甚至高达90%以上.该病导致桑树生长不良,桑叶产量大幅度减产,桑叶质量下降,影响蚕茧产量和质量,严重制约我国蚕桑生产的发展.

利用深度测序技术鉴定疑似桑花叶卷叶病感病桑树叶片中的相关病毒

植物通过小干扰RNA(siRNA)介导的RNA干扰机制来防御外来病毒感染,通过对感病植物材料小RNA(sRNA)的深度测序,获得这一过程中产生的与病毒序列高度一致的siRNA序列信息,可以快速地鉴定侵染植物的病毒组成。以采集自浙江省桐乡市桑园疑似感染桑花叶卷叶病(原称桑花叶型萎缩病)的桑树叶片为材料提取总RNA,构建sRNA文库并进行深度测序,对测序得到的总sRNA进行组装后,比对鉴定出桑花叶卷叶病相关病毒(mulberry mosaic leaf roll-associated virus,MMLRa V),并分别得到占MMLRa V 2个组分全基因组14.19%和21.86%的核酸序列。进一步以感病桑叶组织的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得部分MMLRa V基因组序列,经Sanger测序确定采集的感病桑树叶片中只存在MMLRa V。通过生物信息学方法分析表明,MMLRa V来源siRNA在基因组中的长度分布、5'端碱基偏好性及热点区分布等具有明显特点。研究结果显示,利用siRNA深度测序技术鉴定桑树病毒是非常高效的手段。

抗桑花叶萎缩病的桑品种筛选与应用

桑花叶萎缩病是桑树的一种类病毒病害,栽植抗病桑品种是最经济有效的病害防控策略。在桑花叶萎缩病发病严重的桑园内筛选出凤尾芽变、大中华2个对病害抵抗力较强、产量性状优的桑品种,并将这2个抗病品种的接穗用冠接法嫁接浙江省湖州市病区桑园的发病桑树。其中,凤尾芽变接穗的嫁接成活率为76.5%,病树康复率达100%;大中华接穗的嫁接成活率为52.9%,病树康复率为88.89%。此外,嫁接成活后的病树均生长良好。初步认为,筛选抗病力较强的桑品种用于桑花叶萎缩病发病桑树的嫁接改造,是快速有效防控病害的技术途径之一。

桑花叶卷叶病相关病毒外壳蛋白抗体的制备及利用

对桑花叶卷叶病相关病毒外壳蛋白抗原性较好的核心结构域进行克隆和序列多样性分析,结果表明50个克隆中有19个克隆株,CP16为优势株。构建重组表达载体pET-28a-SUMO-CP16,成功在大肠杆菌Rosetta中诱导表达该蛋白,利用亲和层析纯化重组蛋白并制备多克隆抗体。经Western杂交和ID-ELISA检测合格的抗体偶联Tosylactivated磁珠,用于桑花叶卷叶病相关病毒的纯化。经qPCR技术检测显示,纯化后的病毒样本中的背景RNA得到极大的减少,获得了高纯度的病毒样品。

分子生物技术检测桑花叶型萎缩病原

根据多年对桑花叶型萎缩病的追踪研究,分离获得了病桑组织类似类病毒的小分子RNA,对其部分序列进行解析,并以之作为病原物的分子标志物,用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、点杂交和Northern-blot等分子生物技术方法检测症状明显的病株,取得了比较理想的结果。

桑花叶型萎缩病相关病毒的 IMSA-LAMP检测方法获得新进展

桑病毒病是桑树常见的病害,一旦暴发会影响桑树的产量和桑叶的品质,其中又以桑花叶型萎缩病的影响最大。虽然对桑花叶型萎缩病的研究最为广泛,但对该病害早期病症的预知检测,以及引发桑花叶型萎缩病相关病毒(Mulberry mosaic dwarf associated virus,MMDaV)的鉴别与研究则鲜见报道。

扶桑花中石油醚溶物的结构测定和抗生育活性研究

扶桑花中的石油醚溶物经活性追踪，得到一白色针状结晶．分析表明，该结晶为扶桑甾醇氧化物，具显著的抗生育活性．