桑花叶萎缩类病毒的检测与序列多态性分析

为调查桑花叶萎缩类病毒的多态性,通过RT-PCR技术分离了安康地区桑花叶型萎缩类病毒,并对其基因组进行了克隆测序和序列分析。结果获得4个MMDVd变体,核苷酸长度为356 nt或357 nt,GC含量均约51%,Mfold网站预测二级结构两端为分枝状结构,其中约有58%的碱基配对。

桑花叶萎缩类病毒基因组结构特征及聚类分析

桑花叶萎缩类病毒（Mulberry mosaic dwarf viroid, MMDVd）是近些年发现的桑花叶型萎缩病的病原物,本研究利用Mfold等软件和保守序列分析了MMDVd的二级结构及其中存在的核酶,并进一步对类病毒和卫星RNA进行了聚类分析,以期解决其分类和进化地位。结果表明MMDVd的正链存在典型的锤头型核酶结构,自切割位点为AUC,负链存在有疑似发夹型核酶的二级结构,是目前发现的第四个发夹核酶。聚类分析研究中,Pospiviroidae科类病毒单独形成一分支,Avsunviroidae科PLMVd和CChMVd首先与v LTSV聚合,而本研究MMDVd首先与卫星RNA s TRSV、s ArMV聚合,结合MMDVd正负链不同于已知Avsunviroidae科的两个锤头型核酶的结构,表明MMDVd应为一个新的未分类属,对于其核酶的自切割活性及其复制机制,则需要进一步的实验研究来验证。

桑花叶萎缩类病毒滚环扩增检测技术体系的建立

为建立一种快速、灵敏、简单的检测类病毒的方法,以桑花叶萎缩类病毒为研究对象,根据其基因组设计了1条特异性连接环化的寡核苷酸链探针和2条PCR扩增检测引物,对收集到的6份桑花叶型萎缩类病毒样品进行了滚环扩增。结果所有样品的RCA扩增产物的核酸电泳,条带呈阶梯状分布,但大部分聚集于上样孔附近,与理论分析相符,表明该方法适用于桑花叶萎缩类病毒的快速检测。进一步利用人工合成的模拟DNA分子测试该检测方法的灵敏度,研究显示,利用RCA技术可以成功检测到10~3拷贝的模式DNA分子。

桑花叶萎缩类病毒基因组核酶活性及其对桑树侵染性的研究

桑花叶萎缩类病毒(Mulberry mosaic dwarf viroid,MMDVd)基因组由单链环状小分子RNA组成,根据预测二级结构可能存在锤头核酶(Hammerhead ribozyme,HH)和疑似发夹核酶(Hairpin ribozyme,HP),但目前还缺乏对核酶活性的研究。本研究使用体外自切割和2,3-环磷酸基测序对核酶活性及自切割位点进行了鉴定,并在发夹核酶Loop1增加一对碱基设计合成了突变核酶MMDVd-HP’,比较了其与MMDVd-HP的活性差异,分析了MMDVd对正常未染病和桑花叶卷叶病相关病毒(Mulberry mosaic leaf roll-associated virus,MMLRaV)阳性桑树的侵染。体外自切割结果显示,所有核酶均成功自切割产生了相应的单体,均有核酶活性。2,3-环磷酸基测序结果显示,腺苷化接头分别连接于第7位的C和302位的A之后,MMDVd-HH的切割位点位于AUC↑处,MMDVd-HP切割位点位于ACA↓处。定量PCR结果显示反应体系中的MMDVd-HP多于MMDVd-HP’,表明MMDVd-HP’更多的发生了切割,活性高于MMDVd-HP。侵染性实验结果显示,桑树(-)没有检测到MMDVd,而所有桑树(MMLRaV)样本均检测到了MMDVd,说明MMDVd能侵染桑树(MMLRaV),与satRNA的特征相似。

利用组织培养技术繁育桑树无病毒苗的试验

桑花叶萎缩病是危害桑树的主要病害之一,其病原物为类病毒(viroid)。以感染桑花叶萎缩病的桑树植株茎尖为外植体繁育无毒桑苗,可以有效控制该病的蔓延。通过正交试验对启动培养基中植物激素的添加浓度进行优化,筛选出最适合外植体生长的培养基配方为MS+0.5 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.1%PVP-40,最适合外植体生根的培养基配方为1/2MS+0.25 mg/L 2,4-D+0.1%PVP-40。根据已报道的桑花叶萎缩类病毒的核苷酸序列设计引物,对组培桑苗叶片cDNA进行RT-PCR扩增,所有样品中均没有检测到桑花叶萎缩类病毒特异条带。试验结果表明,以感染桑花叶萎缩病的桑树茎尖为外植体,通过组织培养方法可以获得健康的脱毒苗。

桑树病毒与病毒病的研究进展(Ⅱ)

业已明确的桑树病毒病有10种。在前文报道部分桑树真病毒及病害的研究进展之后,再重点介绍桑花叶萎缩类病毒及病害的研究进展,包括病原物提取、基因组序列分析、寄主范围、致病特征、诊断方法和病害控制等,为桑花叶萎缩类病毒的深入研究以及病害的有效防治提供参考。

过量表达马铃薯ataxin-3可增加泛素积累并反向调控本氏烟生长

动物细胞中ataxin-3与泛素特异结合,通过去泛素化阻止蛋白质水解;基因组注释预测ataxin-3同源物存在于植物中,但到目前为止尚未见植物ataxin-3基因功能的研究报道;本研究克隆了马铃薯（Solanum tuberosum） ataxin-3编码基因StAX c DNA,转化StAX于本氏烟（Nicotiana benthamiana）基因组,筛选获得StAX过量表达株系stax-9;测定结果显示,stax-9叶片ataxin-3、UBI 3和CDC48 mRNA积累显著增加,stax-9叶片ataxin-3、寡聚泛素和总蛋白积累分别比WT株系增加了138%、81%和38%,而赤霉素含量仅是WT的1/6;研究结果表明,ataxin-3本氏烟体内过量表达,显著增强了泛素转录和翻译,增加了总蛋白积累,减少了赤霉素积累,导致半矮化表型;结论认为植物ataxin-3通过正向调控泛素和蛋白积累,反向调控生长;本研究为植物ataxin-3功能的进一步理解提供依据。

寄主和非寄主植物中MMDVd正负链比例的研究

引物特异反转录结合实时荧光定量PCR技术对MMDVd在寄主和非寄主植物体内正负链的积累差异进行了研究。根据MMDVd基因组序列,设计了3对反向互补的反转录引物,对桑树和拟南芥中的MMDVd的正负链进行引物特异的反转录,荧光定量PCR技术对纯化后的c DNA进行定量分析。分析表明,桑树中,3组反转录引物的结果都是负链高于正链,为2~9倍,而拟南芥中,正负链的比例不定,显示了较高的随机性。本研究可为进一步的类病毒的侵染机制及其寄主域的研究提供参考。