5种杀菌剂对桑褐斑壳丰孢病菌的抑制活性和对家蚕的毒力测定

为筛选对桑褐斑病病原菌有高效抑制作用且对养蚕生产安全的杀菌剂,在室内测定了5种杀菌剂对桑褐斑壳丰孢[Phloeospora maculans（Bereng.）Allesch]病菌的抑制活性,以及对家蚕（Bombyx mori）3龄起蚕的急性毒性。5种杀菌剂对桑褐斑壳丰孢病菌的菌丝生长抑制活性从高到低依次为苯醚甲环唑、丙环唑、氟环唑、戊唑醇、嘧菌酯,以上排序杀菌剂对菌丝生长的抑制中浓度（EC50）分别为0.006 6、0.020 5、0.028 9、0.258 0和2.265 0 mg/L;5种杀菌剂对病原菌孢子萌发的抑制活性从高到低依次为嘧菌酯、苯醚甲环唑、丙环唑、戊唑醇、氟环唑,以上排序杀菌剂对病原菌孢子萌发的EC50分别为12.835 5、16.996 4、19.491 8、20.466 1和30.025 2 mg/L。5种杀菌剂对3龄起蚕的24 h毒性从大到小依次为嘧菌酯、氟环唑、苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑,以上排序杀菌剂对3龄起蚕的致死中浓度（LC50）分别为899.075 8、1 728.665 7、1 914.126 6、3 283.528 3、6 058.064 5 mg/L,均表现为低毒性。试验结果提示,嘧菌酯对病原菌孢子萌发有较高的抑制活性,可以用于桑园中对桑褐斑病的预防;其余4种三唑类杀菌剂对病原菌的菌丝生长有较高的抑制活性,可以用于感染桑褐斑病的桑树的治疗。具体的施药方案,则需要进一步评估田间用药对家蚕的安全风险性后确定。

基于ISSR标记的云南桑褐斑壳丰孢菌遗传多样性分析

为明确云南省桑褐斑病病原菌桑褐斑壳丰孢菌(Phloeospora maculans)的遗传多样性及亲缘关系,采用ISSR分子标记对分离自云南省不同县市的58株桑褐斑壳丰孢菌进行遗传多样性分析。结果显示,物种水平上,Nei’s多样性指数H为0.276 3,Shnanon信息指数I为0.421 0,表明云南桑褐斑病病原菌具有丰富的遗传多样性;遗传距离分析表明,保山和曲靖的菌株种群遗传相似系数最高为0.945 0,亲缘关系最近,保山和蒙自的菌株种群遗传相似系数最低为0.870 6,亲缘关系相对较远;居群每代迁移数N_(m)为1.889(>1),表明不同地理种群间存在一定的基因流动;利用NTSYS软件按UPGMA方法聚类分析,58株桑褐斑壳丰孢菌的遗传相似系数在0.69~1.00之间,当相似系数为0.73时,可将58个供试菌株分为4个类群,但菌株并没有按地理来源聚为不同的组,表明菌株之间的遗传多样性与其地理来源无明显的相关性。

桑褐斑壳丰孢菌Phloeospora maculans的主要生物学特性研究

桑褐斑壳丰孢（Phloeospora maculans）是近几年鉴定的云南蚕区桑园发生桑褐斑病的主要病原菌之一。采用菌丝生长速率法研究不同培养基及碳源和氮源、p H值、温度、光照条件对该病原菌菌丝生长与产孢量的影响。结果表明,桑褐斑壳丰孢的菌丝适宜在PDA培养基和PDA＋1%桑叶碎片培养基（简称PDA桑叶培养基）上生长,其中PDA桑叶培养基是最佳的产孢培养基;菌丝生长最佳培养基中的碳源和氮源物质分别是麦芽糖、蛋白胨,以可溶性淀粉为碳源的培养基产孢量最大,而在所有有氮源和无氮源物质的培养基上均不产孢;菌丝生长的最适培养基p H值为6-9,而p H 6时产孢量最大;在22-28℃培养条件下,菌丝生长最快,产孢量最大;连续黑暗条件适合菌丝生长和产孢;菌丝的致死温度条件为50℃水浴处理10 min。上述研究结果提示桑褐斑壳丰孢有很强的营养利用和环境适应能力。

桑褐斑壳丰孢菌pmcamk基因的克隆与表达时相分析

钙/钙调素依赖性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinases, CAMK)作为钙信号途径中的关键蛋白,在多种细胞过程中发挥重要作用。以桑褐斑壳丰孢菌(Phloeospora maculans)为研究对象,利用反转录PCR结合RACE技术克隆桑褐斑壳丰孢菌(Phloeospora maculans)钙/钙调素依赖性蛋白激酶基因pmcamk的序列全长,利用荧光定量PCR技术,研究pmcamk在桑褐斑壳丰孢菌侵染宿主后不同时期以及其分生孢子在水中萌发过程中的表达模式,以期深入了解桑褐斑壳丰孢菌Ca^(2+)信号转导途径与孢子萌发之间的关系。结果表明,pmcamk的cDNA序列全长为1 422 bp,由1 221 bp的开放阅读框和201 bp的3′非翻译区组成,GenBank登录号为MK713976。pmcamk开放阅读框共编码406个氨基酸残基,蛋白质分子质量约为45.5 kD,等电点为6.28。系统进化树分析表明桑褐斑壳丰孢菌与小麦叶枯病菌的CAMK同源性最高,属于CAMKⅠ类群并且聚类在同一进化分支。在桑褐斑壳丰孢菌侵染桑树的早期阶段(0.25、 0.5、1 d),pmcamk的表达量呈上升趋势,在侵染后2、3、4、6 d其表达量逐渐下降。这与不同时间阶段桑褐斑壳丰孢菌在水中萌发过程中pmcamk的表达趋势基本一致,推测PmCAMK在桑褐斑病菌孢子萌发过程中发挥着重要作用。

云南蚕区采集桑褐斑病病原真菌基于rDNA-ITS序列的分类鉴定与系统发育分析

已报道的桑褐斑病的病原真菌有桑粘隔孢(Septogloeum mori Briosi et Cavara)和桑褐斑壳丰孢[Phloeospora maculans(Bereng.)Allesch]两种。在云南省不同蚕区选择感染桑褐斑病的桑树分离病原菌株,以待测病原菌株的基因组DNA为模板,采用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增各菌株的r DNA-ITS序列。对菌株PCR产物测序后比对Gen Bank数据库中已提交桑褐斑病病原菌的r DNA-ITS同源序列,应用MEGA5.2软件和Neighbor-Joining法,分别计算遗传距离及构建系统发育进化树分析亲缘关系。结果表明,从云南省不同蚕区感病桑树分离的桑褐斑病病原菌r DNA-ITS序列与Gen Bank中登录桑褐斑壳丰孢P.maculans的r DNA-ITS序列(登录号:GU214670.1)、桑球腔菌[Mycosphaerella mori(Fckl.)Wolf]r DNA-ITS序列(登录号:AB435069.1)的遗传距离很近,序列相似度达99%以上,聚为同一分支,其中编号BS、DY、ML、QJ的菌株与来自印度的桑球腔菌的序列相似度达到100%。由此认为,引起云南蚕区桑褐斑病的病原真菌为桑褐斑壳丰孢Phloeospora maculans,有性态为桑球腔菌Mycosphaerella mori。

椒碱烯酰胺对桑褐斑病的防效及对家蚕的毒性

为了探索杀菌剂椒碱烯酰胺用于蚕业生产上防治桑褐斑病的可行性,采用菌丝抑制法测定椒碱烯酰胺对其病原真菌桑褐斑壳丰孢菌(Phloeospora maculans)的毒力,采用田间喷雾法进行田间防治试验,并采用食下毒叶法测定其对非靶标生/L,抑制效果明显高于对照药剂甲基硫菌灵;田间用药2次后,椒碱烯酰胺300倍稀释液防效最高为4458%,500倍稀释液为3249%,对照药剂甲基硫菌灵1000倍稀释液为004%。椒碱烯酰胺对3龄起蚕的致死中浓度(LC50)为18166 mg/L,约为甲基硫菌灵的19倍。椒碱烯酰胺对家蚕龄期经过、茧层量和健蛹体质量无明显影响,但会影响眠蚕的体质量。研究结果可以为用椒碱烯酰胺与化学农药配伍防治桑褐斑病提供依据。

嘧菌酯与戊唑醇混配对桑褐斑病病菌的联合毒力

为明确嘧菌酯与戊唑醇混配对桑褐斑壳丰孢菌(Phloeospora maculans)的联合毒力,采用菌丝生长抑制法和分生孢子萌发法测定了嘧菌酯和戊唑醇单剂对桑褐斑壳丰孢菌菌丝和分生孢子的毒力;在单剂毒力的基础上采用毒性比率法测算了嘧菌酯和戊唑醇的增效配比范围,并采用共毒系数法明确了最佳增效配比。试验结果表明,嘧菌酯和戊唑醇对桑褐斑壳丰孢菌菌丝的半抑制浓度(EC 50)分别为2.27 mg/L和0.26 mg/L,对桑褐斑壳丰孢菌分生孢子的EC 50分别为12.84 mg/L和20.47 mg/L;增效系数测定在嘧菌酯与戊唑醇的质量比分别为35∶1、20∶1、13∶1、9∶1、6∶1、4∶1时对桑褐斑壳丰孢菌的毒性比率分别为1.86、1.69、1.78、1.75、1.73、1.70,均大于1.69,表现为增效作用;其中嘧菌酯与戊唑醇的质量比在25∶1时共毒系数最高为260.91,对桑褐斑壳丰孢菌的EC 50为0.67 mg/L。该结果可以为嘧菌酯与戊唑醇混配防治桑褐斑病提供参考。