桔梗素D通过下调成纤维细胞TRPC6表达改善小鼠肺纤维化

目的探究桔梗素D(PD)对肺纤维化的影响及其机制。方法博来霉素(BLM)气道内滴入构建C57BL/6J小鼠肺纤维化模型,再予PD(10 mg/kg)灌胃,28 d后处死小鼠。分组如下:对照组(control)、BLM(10 mg/kg)模型组、BLM(10 mg/kg)+PD(10 mg/kg)组。肺组织石蜡切片HE染色、免疫组化和天狼星红染色评估小鼠肺组织纤维化程度和瞬时受体电位离子通道亚族C成员6(TRPC6)的表达与分布。Westernblot检测肺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平。小鼠原代肺成纤维细胞体外培养,分别用PD、TRPC6抑制剂醋酸落叶松酯(LA)预处理后加入转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激细胞,根据加入的TGF-β1和PD浓度不同分组如下:control组、TGF-β1(10 ng/mL)组、PD(2.5μmol/L)+TGF-β1组、PD(5μmol/L)+TGF-β1组和PD(10μmol/L)+TGF-β1组,LA处理分组如下:control组、TGF-β1(10 ng/mL)组和LA(10μmol/L)+TGF-β1组,测定细胞存活率、collagenⅠ、α-SMA和TRPC6的表达水平、活性氧(ROS)生成水平、线粒体膜电位、细胞增殖能力等指标。利用网络药理学方法结合文献分析PD作用于肺纤维化可能通过的机制。结果PD可明显减轻BLM诱导小鼠模型的肺部纤维化程度、减少α-SMA表达(P<0.05)。CCK-8结果显示PD、TGF-β1和LA的最适宜刺激浓度分别是10μmol/L、10 ng/mL和10μmol/L;5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)染色结果显示PD能够有效抑制肺成纤维细胞增殖;2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色显示PD能有效减少TGF-β1诱导的细胞ROS生成(P<0.0001);线粒体膜电位检测(Jc-1染色)结果显示PD能有效缓解TGF-β1诱导的细胞线粒体膜电位下降(P<0.001);蛋白电泳结果显示PD能显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA和collagenⅠ的表达(P<0.05)。网络药理学结合文献分析发现PD可能通过TRPC6作用于肺纤维化。免疫组织化学结果显示PD明显减轻了BLM诱导的肺组织TRPC6表达。蛋白电泳结果显示PD可明显抑制TGF-β1诱导的TRPC6表达(P<0.05);使用LA可明显抑制细胞TRPC6、α-SMA、collagenⅠ的表达(P<0.05)。结论PD可降低小鼠肺纤维化,其机制可能与下调TRPC6并减少ROS产生有关。