桥粒芯胶蛋白3前导肽基因的克隆和原核表达

目的 :克隆人桥粒芯胶蛋白 3前导肽 (Dc3p)基因 ,并进行表达、纯化和鉴定。方法 :用PCR法从桥粒芯胶蛋白 (Dc)cD NA文库中扩增出Dc3p基因 ,与pGEX 4T 2载体连接成重组表达质粒pGEX 4T 2 Dc3p ;重组质粒转入BL2 1大肠杆菌 ,经诱导表达谷胱甘肽S 转移酶 Dc3p(GST Dc3p)融合蛋白 ,该蛋白经GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱纯化 ,SDS PAGE和免疫印迹法检测鉴定。结果 :经酶切及序列分析鉴定 ,重组质粒pGEX 4T 2 Dc3p成功构建 ,诱导后高表达GST Dc3p融合蛋白并得到纯化 ,免疫印迹法证实表达蛋白为GST Dc3p。结论 :获得高表达、高纯度的GST Dc3p融合蛋白 ,为Dc3p的功能及免疫学分析打下基础。

氧化脂蛋白(a)通过抑制桥粒芯糖蛋白1和桥粒芯胶蛋白2的表达增加单层内皮细胞的通透性

目的探讨氧化脂蛋白(a)[oxLp(a)]对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上跨膜蛋白桥粒芯糖蛋白1(DSG1)以及桥粒芯胶蛋白(DSC2)的表达及单层内皮细胞通透性的影响。方法每次实验前6 h给HUVEC换上新鲜的无血清培养基,使细胞饥饿,6 h后再换上新鲜的培养基并加入不同浓度的oxLp(a)(0、25、50、100 mg/L)孵育HUVEC 24 h;100 mg/L oxLp(a)分别处理HU-VEC不同时间(0、6、12、24 h),RT-PCR和Western blot分别检测DSG1、DSC2 mRNA以及蛋白的表达。Transwell上种植单层HUVEC,100 mg/L oxLp(a)处理HUVEC 24 h后,于Transwell上室加入100μL1 g/L的FITC-dextran,分别在不同的时间点(0min,15 min,30 min,1 h,2 h,4 h)收集下室中的液体,用荧光分光光度计测量液体的荧光强度,确定测量通透性的最佳时间;用不同浓度的oxLp(a)(0、25、50、100 mg/L)分别或者与SOD(100 mg/L)共同孵育HUVEC 24 h后,在上室中加入FITC-dextran孵育2 h,空白组作为对照,取下室中的液体测量荧光强度。结果 oxLp(a)使HUVEC上DSG1、DSC2的表达下调,在25 mg/L时即有显著作用,且随着oxLp(a)浓度的升高,DSG1、DSC2 mRNA和蛋白表达水平呈浓度依赖的下降趋势(P<0.05);oxLp(a)孵育HUVECs 6 h即能显著地下调DSG1、DSC2的表达,且随着处理时间的延长,DSG1、DSC2 mRNA和蛋白表达水平呈时间依赖的下降趋势(P<0.05)。oxLp(a)剂量依赖性增加单层内皮细胞的通透性,100 mg/L作用最显著(P<0.05),2 h是测量通透性的最佳时间;100 mg/L oxLp(a)引起的单层内皮细胞通透性的增加能够被SOD所抑制(P<0.05)。结论 oxLp(a)呈浓度依赖性和时间依赖性的方式下调HUVECs上DSG1、DSC2的表达,并相应地增加单层内皮细胞的通透性。

桥粒芯胶蛋白-1与头颈部鳞状细胞癌发生及预后相关性的研究

目的:本研究拟探讨桥粒芯胶蛋白-1与头颈部鳞状细胞癌发生及预后的相关性。方法:本研究通过对NCBI数据库GEO获取的基因芯片数据进行统计学分析,并且采用头颈部鳞状细胞癌组织芯片予以验证。免疫组织化学的方法检测了组织芯片中芯胶蛋白-1的表达,并采用统计学方法分析了芯胶蛋白-1的表达与头颈部鳞状细胞癌发生、分化、预后等的相关性。结果:对GEO获取的芯片数据分析发现芯胶蛋白-1在头颈部鳞状细胞癌中表达增高,且表达增高的患者预后较差。组织芯片的验证实验显示结果与GEO数据库获取数据分析结果基本一致,在头颈部鳞状细胞癌中DSC1的表达显著高于正常组织,且在低分化头颈部鳞状细胞癌中表达高于高分化鳞状细胞癌。结论:桥粒芯胶蛋白-1的增高可促进头颈部鳞状细胞癌的发生,且与肿瘤分化相关。此外,其表达增高提示患者预后不良。

桥粒芯胶蛋白-2基因沉默对P19细胞向心肌细胞诱导分化的影响

目的探讨在P19细胞诱导分化成心肌细胞过程中,桥粒芯胶蛋白-2(DSC2)基因沉默对其的影响。方法设计并合成针对DSC2基因编码区的干扰序列,构建真核细胞表达质粒并转染P19细胞。荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测DSC2在mRNA和蛋白水平表达变化,筛选出沉默效率最佳的细胞株。二甲基亚矾诱导分化为心肌细胞,观察其超微结构和细胞凋亡等改变,以及对纤维化与脂肪化相关基因mRNA水平表达的影响。结果成功构建了5种ShDSC2重组质粒,转染P19细胞并获得稳定转染细胞株,筛选出对DSC2基因mRNA水平(69.47%vs 0,P<0.01)和蛋白水平表达(65.62%vs 0,P<0.01)的抑制效率最显著的ShDSC2-613组,并成功诱导分化为心肌样细胞后,电镜扫描显示后者细胞出现脂滴、空泡样变性、线粒体肿胀及嵴消失,流式细胞仪检测提示细胞凋亡显著增加,RT-PCR示纤维化相关基因(Collal、Colla2、Col3a1)与脂肪化相关基因(Adiponectin、PPAR-γ、C/EBP-α)的mRNA表达均显著升高。结论建立能有效抑制DSC2表达的P19细胞株并分化为心肌样细胞,表现出与致心律失常型右室心肌病(ARVC)患者病理和分子生物学特点相似的表型特征,提示其可作为深入研究ARVC致病机制的前体细胞。

TP63对非小细胞肺癌细胞吉非替尼耐药性及DSC3/DSG3基因表达的影响

目的探讨肿瘤蛋白(TP)63对非小细胞肺癌细胞吉非替尼耐药性及桥粒芯胶蛋白(DSC)3/桥粒芯糖蛋白(DSG)3的影响。方法体外培养人非小细胞肺癌吉非替尼敏感细胞株PC9、吉非替尼耐药细胞株PC9/GR,将PC9/GR细胞随机分为对照组、TP63-siRNA组(转染TP63-siRNA)和NC-siRNA组(转染NC-siRNA),用细胞计数试剂盒(CCK)-8法检测转染后细胞吉非替尼半数抑制浓度(IC50)和细胞增殖情况;流式细胞术检测PC9/GR细胞凋亡情况;划痕实验检测细胞迁移;Transwell小室法检测细胞侵袭;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各组细胞TP63、DSG3、DSC3 mRNA表达;蛋白印迹分析法检测各组细胞TP63、DSG3、DSC3蛋白表达。结果与PC9细胞相比,耐药细胞PC9/GR中TP63 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与对照组和NC-siRNA组相比,TP63-siRNA组PC9/GR细胞IC50值,细胞增殖、迁移、侵袭能力,TP63、DSG3、DSC3 mRNA及蛋白表达显著下降,细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。结论TP63在PC9/GR细胞中高表达,干扰TP63表达可抑制DSC3/DSG3表达,逆转PC9/GR对吉非替尼耐药性。

天疱疮小鼠模型研究的现状及进展

天疱疮(pemphigus)是一种机制不明的慢性自身免疫性大疱性疾病。研究和制作其动物模型对疾病的原因、发病机制及治疗措施等具有重要意义,但目前尚无统一的标准方法。本文就国内外天疱疮的小鼠模型(Dsg3-/-小鼠,过继免疫的Rag2-/-小鼠,Dsc3缺陷小鼠,单链可变区抗体scFv致病性)及人皮肤移植免疫缺陷鼠相关研究的现状和进展作一综述。

桥粒钙黏蛋白对皮肤屏障功能影响的研究进展

在细胞与细胞之间,桥粒提供一种强大的黏附作用,将细胞与中间纤维骨架相连,使细胞间的连接更为牢固。桥粒钙黏蛋白是一种Ca2+依赖型的黏附蛋白,主要存在于桥粒中,并且是构成桥粒的重要组成部分。桥粒钙黏蛋白与一些皮肤性疾病息息相关,它能参与黏附并维持组织结构的完整性,一旦桥粒钙黏蛋白的表达下降使组织间黏附丧失,将会导致一些皮肤性疾病如天疱疮、水疱性脓疱病和葡萄球菌性烫伤样皮肤综合症等的发生。桥粒钙黏蛋白家族成员具有多样性且各种蛋白在组织不同部位的表达具有复杂性,将对桥粒钙黏蛋白家族的成员及其在皮肤疾病方面的性质和功能作一个较全面的综述。