梅毒螺旋体TpN15-47融合基因原核表达系统的构建

目的构建梅毒螺旋体TpN15-47融合基因及其原核表达系统。方法分别克隆TpN15和TpN47基因,利用T4连接酶构建TpN15-47融合基因,常规方法构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白TpN15-47表达情况。结果连接的TpN15-47基因测序分析表明,插入的基因片段为TpN15-47融合基因,与GenBank报道相同。目的重组蛋白TpN15-47表达产量约为细菌总蛋白85.79%,主要以包涵体形式存在。结论所构建的原核表达系统能高效地表达TpN15-47融合蛋白,为后期梅毒螺旋体基因疫苗和临床检测试剂盒的研制奠定了基础。

梅毒螺旋体TpN47基因分析及实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的确定不同梅毒螺旋体TpN47基因序列的差异性及其跨膜结构,建立基于TpN47基因检测梅毒螺旋体的荧光定量PCR方法。方法通过使用NCBI/Blast,Pfam,TMHMM Server v.2.0等网络资源分析梅毒螺旋体TpN47基因编码蛋白的保守功能结构域和跨膜区域。根据参考序列设计引物,采用PCR技术从梅毒螺旋体基因组DNA中扩增TpN47基因,将其连接入克隆载体pMD18-T进行测序,并用DNASTAR软件比较不同梅毒螺旋体菌株TpN47基因的核苷酸序列。根据梅毒螺旋体TpN47基因保守区域设计引物,建立基于该目的基因的荧光定量分析PCR检测方法并分析其灵敏度、特异性和稳定性。同时,采用基于TpN47基因的荧光定量PCR对梅毒螺旋体感染患者血液样本进行检测。结果研究表明,梅毒螺旋体TpN47基因为梅毒螺旋体外膜蛋白编码基因,其产物定位于外膜表面。不同梅毒螺旋体菌株中TpN47基因的核苷酸序列保守,相似度达99%以上。基于TpN47基因的荧光定量PCR方法可有效地检测梅毒螺旋体感染患者血清及泌尿道分泌物样本中的梅毒螺旋体。结论 TpN47基因为梅毒螺旋体外膜蛋白编码基因,建立的基于TpN47基因的荧光定量PCR方法具有快速、敏感、稳定等优点,适用于梅毒螺旋体临床实验室诊断。

梅毒螺旋体TpN15重组抗原的克隆与表达

目的：用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN15重组抗原，为进一步研制梅毒螺旋体疫苗和ELISA诊断试剂盒奠定基础。方法：采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN15基因，进行T-A克隆及测序，然后亚克隆到原核表达载体中，以亲和层析法纯化重组蛋白。结果：成功地构建了pET32-TpN15重组表达载体，TpN15重组蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达。结论：梅毒螺旋体TpN15基因在大肠杆菌中的成功表达为临床检测梅毒感染的新方法和梅毒螺旋体疫苗的研制奠定了基础。

梅毒螺旋体特异抗原 P15、P47的克隆表达和临床应用

目的 :克隆表达梅毒螺旋体特异抗原 P15、P47,用于临床检测梅毒感染。方法 :化学合成 p15、p47基因并插入 GST融合蛋白表达载体 ,以亲和层析进行纯化。将重组 P15、P47抗原包板制备酶联免疫检测试剂盒 ,对国家标准品、正常人群、梅毒患者等的血清进行检测。结果 :化学合成的 p15、p47基因 ,测序结果与 Gen Bank数据符合。将重组 P15、P47抗原包板制备酶联免疫检测试剂盒 ,对国家标准品的检测全部符合 ,对正常人群、梅毒患者和其他一些疾病患者的检测显示很高的灵敏度和特异性。 结论 :用重组梅毒 P15和

ltB-TpN47融合基因原核表达系统的构建

目的分别从梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)临床菌株和大肠杆菌DNA中扩增ltB和TpN47基因,构建ltB-TpN47融合基因及其原核表达系统。方法采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增TpN47基因和ltB基因片段、构建ltB-TpN47融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。采用质粒pET32和宿主菌E.coliBL21DE3构建ltB-TpN47融合基因原核表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达。结果所构建的ltB-TpN47融合基因核苷酸序列与从GeneBank中查询并处理得出的数据基本一致。所构建的表达系统pET32-ltB-TpN47的目的重组蛋白(rltB-TpN47)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右。结论本文成功地构建了ltB-TpN47融合基因高效原核表达系统。

梅毒螺旋体TpN15抗原重组表达及rTpN15-ELISA血清学检测效果

目的:克隆并构建梅毒螺旋体tpN15基因原核表达系统,建立基于rTpN15的ELISA并对其用于梅毒血清学诊断的敏感性和特异性进行评价。方法:采用PCR扩增tpN15基因,构建tpN15基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rTpN15表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rTpN15,Western blot鉴定rTpN15的免疫反应性。以rT-pN15为包被抗原,建立rTpN15-ELISA并用于检测138例梅毒病人血清,其检测结果与RPR和TPHA进行比较。结果:克隆的tpn15基因与GenBank中相关序列相似性为100%。rTpN15表达量为细菌总蛋白的23.4%。提纯的rTpN15在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。TPHA阳性的梅毒病人血清能有效识别rTpN15并与之结合。rTpN15-ELISA对梅毒病人血清标本检测阳性率为96.4%(133/138),与TPHA检测阳性率(97.8%,135/138)相近(P>0.05),rTpN15-ELISA和TPHA检测阳性率均显著高于TRUST(82.6%,114/138)(P<0.01)。结论:本研究中成功地克隆并构建了梅毒螺旋体tpN15基因及其原核表达系统。以rTpN15为包被抗原的rTpN15-ELISA可作为快速、简便、敏感和特异的梅毒血清学筛查方法。

一种荧光定量PCR方法检测血液标本中梅毒螺旋体的应用研究

目的建立基于TpN17基因检测血液中梅毒螺旋体的荧光定量PCR方法。方法根据梅毒螺旋体TpN17基因保守区域设计引物,构建质粒标准品pTpN17,优化定量PCR反应体系检测该体系的灵敏度和特异性;同时,采用该方法对梅毒确证阳性的血液样本进行检测。结果研究表明,基于TpN17基因的SYBR GREEN荧光定量PCR方法可以有效检测血液中10^6-10^1 copies/μL的梅毒螺旋体并通过熔解曲线判定结果的特异性。结论以TpN17基因为扩增目的基因的SYBR GREEN荧光定量PCR方法具有灵敏快速便宜的特点,适用于在血液检测梅毒螺旋体,能广泛应用于献血及血液样本检测等领域,提高我国的血液安全。

免疫PCR法诊断梅毒螺旋体抗原和抗体的方法学研究

目的建立免疫PCR方法检测梅毒螺旋体抗原和梅毒螺旋体抗体两种方法学,并比较两种方法学的敏感性、特异性和重复性。方法选择2011年我院梅毒血清学ELISA法检测者1520例并梅毒分期;建立免疫PCR法检测梅毒螺旋体抗原和梅毒螺旋体抗体两种方法,然后对梅毒螺旋体血清学阳性标本10倍系列稀释,比较免疫PCR法敏感性;同时采用正常健康血清标本观察免疫PCR法特异性;最后采集梅毒阳性血液分装成两份标本,监测两种免疫PCR法试验批内和日间重复性。结果 1 520例患者中,梅毒患者136例。梅毒患者中女性占77.2%(105/136),孕妇占19.1%(26/136)。梅毒分期以一期梅毒感染为主,与其他期比较具有统计学意义(P<0.05)。IPCR-Ag法检测梅毒螺旋体抗原敏感性是ELISA法的104倍,TPPA和TRUST法的106。IPCR-Ab法检测梅毒螺旋体抗体敏感性是ELISA法的103倍,TPPA和TRUST法的105。两种免疫PCR法测检查正常健康人群梅毒螺旋体结果均为阴性。IPCR-Ab法试验批内CV为11.61%,日间CV为18.12%;IPCR-Ag法试验批内CV为18.61%,日间CV为22.24%,两者相比具有统计学意义(P<0.05)。结论免疫PCR法检测梅毒螺旋体具有高度的敏感性和特异性,但重复性较差。

梅毒螺旋体荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立基于TPN47基因检测血液中梅毒螺旋体的荧光定量PCR检测方法。方法根据梅毒螺旋体TPN47基因的参考序列设计引物和探针,对收集到的200份血液样本进行荧光定量PCR检测,并分析其灵敏性和特异性,同时,对扩增片段进行测序确认。结果荧光定量PCR方法可以扩增到梅毒螺旋体TPN47基因区164 bp长DNA片段,此方法特异性和敏感性都很高;基于TPN47基因的荧光定量PCR方法测定,TPPA阳性血清和TPPA阴性血清的符合率分别为99%(198/200)和98%(196/200)。结论以TPN47基因为扩增的荧光定量PCR方法具有灵敏、快速、便宜等优点,适用于梅毒螺旋体临床实验室诊断。

免疫印迹法检测TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体表达在梅毒诊断中的应用评估

目的通过对4种血清学梅毒实验方法比对,评估免疫印迹法检测TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体表达在梅毒诊断中的应用。方法于2018年6月~2019年6月,收集河北燕达医院28 417例梅毒筛查样本,综合化学发光微粒子免疫(CMIA)检测结果 S/CO值、梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)结果及快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)检测结果进行分组,确认实验以梅毒螺旋体抗体免疫印迹试验(TP-WB)平行测定3组标本。相关分析采用Pearson r距离法;数据分类可视化采用主成分分析法。采用Medcalc软件进行ROC曲线统计分析,计算曲线下面积,确定CMIA法对梅毒诊断效能最大时的S/CO最佳截断点;不同诊断方法计数资料的比较采用卡方检验。结果以TP-WB结果为参照,ROC曲线分析发现,当CMIA法S/CO截断值为6.79时,敏感度为79.41%,特异度为96.05%,此时曲线下面积最大为0.911,即6.79为CMIA法的最佳诊断截断值。TPN15,TPN17,TPN45及TPN47抗体表达水平与S/CO比值均呈正相关(P<0.05),相关系数r分别为0.87,0.81,0.87及0.76。当标本中免疫印迹法检测TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体均阳性且着色强度数值高反应性(50~170)时,四种检测方法阳性符合率、总符合率为100%,显示评价方法和比对方法具有高度一致性(P<0.01)。结论活动性梅毒患者TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体表达均阳性且着色强度高反应性,梅毒抗体单阳梅毒特异性抗体TPN17和TPN47抗体表达减少且抗体着色强度降低,阳性率显著减少(P<0.05)。梅毒抗体结果可疑患者中TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体表达明显减少,梅毒血清CMIA法筛查S/CO在6.79以下时,建议进一步采用梅毒免疫印迹检测法进行确证。

免疫PCR技术检测梅毒螺旋体特异性蛋白的意义

目的探讨免疫PCR技术检测梅毒螺旋体特异性蛋白TpN47的意义。方法应用PCR法、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)法和酶素螺旋体明胶颗粒凝集试验(TPPA)法进行检测,比较三者的敏感性和特异性。分别用棉拭子取患者泌尿道处渗出液或血清为标本,所有操作严格按照试剂使用说明书进行,PCR方法用细菌基因组DNA提取试剂盒提取TP基因组DNA,设计TpN47基因的引物,取PCR扩增产物进行电泳检测,然后进行T-A克隆、亚克隆及测序,进行提纯、分析,TRUST法和TPPA法按常规进行。结果单用三种检测方法 ,检出率无显著差异(P>0.05),三种方法的灵敏度、特异性不同,PCR法优于TRUST法和TPPA法(P<0.05)。结论免疫PCR技术检测TpN47抗原具有较高的敏感性和特异性,值得临床重视,对有效控制梅毒的蔓延和胎传梅毒的发生具有重要意义。

TpN47重组抗原的表达及其产物反应原性的初步鉴定

目的探讨梅毒螺旋体外膜蛋白(TpN47)重组抗原及其临床意义。方法采用PCR技术扩增TpN47重组抗原,再进行T-A克隆及测序,然后亚克隆至原核表达载体中,以亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白作为抗原制备酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒,对正常人血清200份、类风湿性关节炎(RA)阳性血清55份、系统性红斑狼疮(SLE)阳性血清34份及梅毒可疑患者阳性血清135份进行检测,其结果与梅毒血凝试验(TPHA)、梅毒甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)的检测结果进行比较。结果成功地构建了pET32-TpN47重组表达载体,重组的TpN47蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达。对梅毒可疑阳性血清采用ELISA、TPHA、TRUST检出阳性率分别为81.48%、98.52%、71.11%;TRUST测出的8份可疑阳性样品及31份阴性样品TPHA检测结果均为阳性,而ELISA检测结果阳性19份。ELISA检测阳性率与TRUST和TPHA比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论TpN47重组抗原具有较好的免疫反应活性,ELISA试剂特异性、敏感性次于TPHA,但明显高于TRUST。

梅毒螺旋体重组蛋白rTpN37为抗原的ELISA的建立与RPR和TPPA血清学检测效果的比较

目的:克隆并构建梅毒螺旋体tpN37基因原核表达系统,建立基于rTpN37的ELISA并对其用于梅毒血清学诊断的敏感性和特异性进行评价。方法:采用PCR扩增tpN37基因,构建tpN37基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rTpN37表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rTpN37,Western blot鉴定rTpN37的免疫反应性。以rT-pN37为包被抗原,建立rTpN37-ELISA并用于检测122例梅毒病人血清,其检测结果与RPR和TPPA进行比较。结果:克隆的tpN37基因与GenBank中相关序列相似性为100%。rTpN37表达量为细菌总蛋白的20.4%。提纯的rTpN37在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。TPPA阳性的梅毒病人血清能有效识别rTpN37并与之结合。rTpN37-ELISA对梅毒病人血清标本检测阳性率为95.9%(117/122),与TPPA检测阳性率(96.7%,118/122)相近(P>0.05),rTpN37-ELISA和TPPA检测阳性率均显著高于RPR(81.1%,99/122)(P<0.01)。结论:本研究中成功地克隆并构建了梅毒螺旋体tpN37基因及其原核表达系统。以rTpN37为包被抗原的rTpN37-ELISA可作为快速、敏感和特异的梅毒血清学筛查方法。

Immuno-PCR法诊断早期梅毒的方法学建立及其应用

目的建立Immuno-PCR法诊断早期梅毒的方法学,评价其灵敏度、特异性、重复性及其临床应用。方法利用基因重组TpN47抗原免疫新西兰兔,制备抗体并用Weston blotting检测;利用抗TpN47抗体作为捕获抗体与血清中TpN47抗原结合,通过链霉亲和素、生物素化抗体、生物素化DNA和PCR扩增等建立Immuno-PCR法检测梅毒螺旋体抗原TpN47体系;评价该方法的灵敏度、特异性和重复性;收集200例临床标本通过Immuno-PCR法、ELISA、TPPA和TURST法进行临床应用比较。结果 Weston blotting结果显示TpN47抗体阳性;Immuno-PCR比ELISA法敏感性强103倍,比TPPA、TURST强105倍;特异性高,重复性好。临床标本中Immuno-PCR法敏感性和特异性分别为86.00%(P<0.05)和100.00%,ELISA法为71.00%和98.00%,TPPA法为65.00%和100.00%,TRUST法为68.00%和95.00%。结论 Immuno-PCR法检测梅毒螺旋体TpN47抗原敏感性高,特异性强,重复性好,可作为梅毒螺旋体感染的早期诊断方法 。