梓葛冻干粉针的局部刺激性、过敏性、溶血性和急性毒性研究

梓葛冻干粉针为课题组研发的用于治疗脑缺血卒中的一种新型中药单体复方制剂，其主要成分为梓醇和葛根素。课题组已对梓葛冻干粉针的质量标准及其对脑缺血卒中疾病的治疗和改善作用等进行了研究悼。本文对其局部刺激性、溶血性、过敏性和急性毒性进行了评价，以为梓葛冻干粉针的新药研发提供参考。

梓葛冻干粉针抗血栓作用实验研究

基于地黄和葛根在中医临床治疗中风疾病的广泛应用[1]及其现代药理学作用[2-3],课题组前期将其药效成分梓醇和葛根素配伍,研制成治疗脑缺血中风的新药--梓葛冻干粉针（lyophilized powder of catapol and puerarin,C-P）.

梓葛冻干粉针对脑缺血／再灌注损伤大鼠脑微血管通透性的影响及其机制研究

本文探讨梓葛冻干粉针对脑缺血/再灌注损伤大鼠脑微血管通透性的影响及其作用机制。选择雄性SD大鼠320只,随机分为假手术组、模型组、葛根素注射液组、尼莫地平组和梓葛冻干粉针3个剂量组。线栓法复制大鼠缺血再灌注模型,分别缺血2 h,于再灌注1、4、7和14 d给药后,取脑提取微血管,分别用Western blot法测定脑微血管中闭合蛋白(Occludin)、紧密连接蛋白-5(Claudin-5)、闭合小带蛋白-1(ZO-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的蛋白表达。结果表明,与模型组相比,再灌注4、7和14 d,梓葛冻干粉针16.40、32.70和65.40 mg·kg-1能抑制脑缺血/再灌注大鼠缺血侧脑皮质层微血管中MMP-9蛋白表达的升高;并促进微血管中Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白表达。说明梓葛冻干粉针影响脑缺血/再灌注损伤大鼠脑微血管通透性的机制可能是通过抑制MMP-9蛋白表达,并促进Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白表达,进而保护和改善脑微血管通透性。

梓葛冻干粉针抗脑神经血管单元炎症及氧化损伤

由梓醇和葛根素配伍制成的抗缺血性中风新药--梓葛冻干粉针（injection of lyophilized powder with catalpol and puerarin,C-P）,可透过血脑屏障并且是安全的[1-2],可明显减少中风模型小鼠大脑梗死灶面积[3].

梓葛冻干粉针的安全性药理学实验

梓葛冻干粉针（lyophilized powder of catalpol and puerarin,C-P）为西南大学中药研究所自主研发的用于治疗脑缺血卒中的一种新型中药单体复方制剂,其主要成分为梓醇和葛根素.研究表明,C-P能通过血脑屏障,可明显减少缺血性脑中风模型小鼠大脑梗死体积百分比,还能抑制血小板聚集,促进血凝块溶解,保护神经细胞,改善神经细胞损伤后的生长形态.

梓葛冻干粉针对脑缺血/再灌注损伤大鼠脑微血管舒缩功能异常的改善作用

探讨梓葛冻干粉针对脑缺血/再灌注损伤大鼠脑微血管舒缩功能异常的改善作用.用线栓法复制大鼠缺血/再灌注模型,分别缺血2h,于再灌注1d,4d,7d和14d给药后,取脑,按照相应试剂盒测定脑组织NOS,ET-1,TXB2和6-Ke-to-PGF1α质量分数.结果表明,与模型组相比,再灌注4d,7d和14d,梓葛冻干粉针16.40mg/kg,32.70mg/kg和65.40mg/kg能显著降低TNOS,iNOS活力,ET-1质量分数,TXB2质量分数及TXB2/6-Ke-toPGF1α的比值(p<0.01),且也能显著升高cNOS活力和6-Ke-to-PGF1α质量分数(p<0.01).得出梓葛冻干粉针有改善脑缺血/再灌注损伤大鼠微血管舒缩功能异常的作用.

梓葛冻干粉针对脑微血管内皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

探讨梓葛冻干粉针对脑微血管内皮细胞(BMECs)缺氧/复氧损伤的保护作用。取新生10 d的SD大鼠乳鼠,分离、培养脑皮层微血管原代内皮细胞,并利用DMEM无糖培养基、三气培养箱缺氧容器(缺糖缺氧2 h)及5%CO2培养箱复氧培养24 h复制缺氧/复氧模型,MTT法BMECs细胞活力,Western blot法检测MMP-9的蛋白表达。结果显示,与模型组相比,梓葛冻干粉针(49.00、98.00μg·m L^(-1))能促进缺氧/复氧模型中BMECs增殖;梓葛冻干粉针(24.50、49.00、98.00μg·m L^(-1))能显著抑制BMECs细胞中MMP-9蛋白表达升高(p<0.05);提示梓葛冻干粉针对脑微血管内皮细胞损伤的保护作用可能与降低MMP-9蛋白表达有关。

梓葛冻干粉针对脑缺血/再灌注损伤大鼠脑微血管通透性的保护作用

本文探讨梓葛冻干粉针对脑缺血/再灌注损伤大鼠脑微血管通透性的影响。选择雄性SD大鼠272只,随机分为假手术组、模型组、葛根素注射液组和梓葛冻干粉针3个剂量组。线栓法复制大鼠缺血再灌注模型,分别缺血2 h,于再灌注1、4、7、14 d给药后,取脑提取微血管,用RT-PCR法测定脑微血管中闭合蛋白(Occludin)、紧密连接蛋白-5(Claudin-5)、闭合小带蛋白-1(ZO-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA表达。结果表明,与模型组相比,再灌注4、7、14 d,梓葛冻干粉针16.40、32.70、65.40 mg·kg^(-1)能抑制脑缺血/再灌注大鼠缺血侧脑皮质层微血管中MMP-9mRNA表达的升高(p<0.01);并促进微血管中Claudin-5、Occludin、ZO-1 mRNA表达(p<0.05)。说明梓葛冻干粉针通过抑制MMP-9基因表达,并促进Claudin-5、Occludin、ZO-1基因表达,进而保护和改善脑微血管通透性。

梓葛冻干粉针剂对人脐静脉内皮细胞体外缺血再灌注模型损伤的保护作用

目的:研究中药单体组方梓葛冻干粉针剂对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外缺血再灌注模型损伤的保护作用。方法:体外培养HUVECs,采用氧糖剥夺(Krebs液)方法建立缺氧-复氧模型以模拟体内缺血再灌注损伤。分为正常组、模型组、尼莫地平组、梓葛低、中、高剂量组,复氧时正常组及模型组给予生理盐水,余组给予相应的药物干预后,测定细胞活力、细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量、细胞外乳酸脱氢酶(LDH)释放量;分析细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达。结果:与正常组相比,模型组A值、SOD活性显著性降低(P<0.05);MDA和NO含量以及LDH释放量均显著性升高(P<0.05),Caspase-3和Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著下降,Bcl-2/Bax显著降低(P<0.01)。与模型组比较,梓葛低剂量组A值显著升高(P<0.05);梓葛低、中剂量组MDA和LDH含量显著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01);梓葛低剂量组NO含量显著降低(P<0.05);梓葛冻干粉针剂的各剂量组SOD活性均显著提高(P<0.05),Bax蛋白水平显著降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2/Bax均显著提高(P<0.05,P<0.01);梓葛中、高剂量组Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论:梓葛冻干粉针剂可显著拮抗缺氧-复氧对人脐静脉内皮细胞的损伤,其机制与抑制细胞自由基的产生、提高抗氧化能力及调节凋亡相关蛋白表达密切相关。

梓葛冻干粉针对气虚血瘀证大鼠凝血功能、血液流变学和NO的影响

目的:探讨复方中药新药制剂梓葛冻干粉针对气虚血瘀证大鼠凝血功能、血液流变学及NO的改善作用。方法:采用饥饿、疲劳、寒湿、惊恐和高脂饮食相结合的方法复制气虚血瘀证模型,玻片法测凝血时间(CT),断尾法测出血时间(BT),同时评价梓葛冻干粉针对凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶(APTT)和凝血酶时间(TT)的影响;电阻法测红细胞压积,全自动血液流变仪测流变学指标;酶法测定血清中NO。结果:梓葛冻干粉针65.40 mg·kg-1能显著延长大鼠CT,BT,PT,APTT,TT;能显著降低血液流变学各项指标;提高血清中NO的水平。32.70 mg·kg-1能明显延长大鼠CT,PT,APTT;降低全血黏度、红细胞聚集指数和全血还原黏度。结论:梓葛冻干粉针具有改善凝血功能、血液流变学指标以及升高血清中NO含量的作用。

梓葛冻干粉针抗脑缺血“神经血管单元”多细胞凋亡的机制

目的:研究梓葛冻干粉针(C-P)抗脑缺血"神经血管单元"(NVU)多细胞凋亡的机制。方法:通过线栓法制作的脑缺血再灌注(I/R)损伤大鼠模型,氧糖剥夺再灌注(OGD/R)损伤的体外NVU模型,采用形态学和免疫学方法,研究C-P抗缺血NVU多细胞凋亡的机制。结果:在I/R损伤模型大鼠实验中,49.00、24.50、12.25μg/m L的C-P均能显著抑制Cleaved Caspase-3、Caspase-3和Bax蛋白表达(P<0.01,P<0.05),降低缺血区神经元、微血管内皮细胞和星形胶质细胞凋亡率(P<0.01),减少梗死灶体积百分比(P<0.01),提高大鼠神经行为学得分(P<0.01)。在OGD/R损伤NVU体外模型实验中,49.00、24.50μg/m L的C-P均能显著抑制Cleaved Caspase-3、Caspase-3和Bax蛋白表达(P<0.01),降低神经元、微血管内皮细胞和星形胶质细胞的凋亡率(P<0.01),增加神经元轴突长度以及星形胶质细胞和微血管内皮细胞的存活数量(P<0.01)。结论:C-P可同时抑制神经元、微血管内皮细胞和星形胶质细胞凋亡,促进其存活,对NVU具有整体保护作用,从而减少缺血区梗死灶体积,起到改善大鼠神经行为学功能的效果。

梓葛冻干粉对人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究中药单体组方梓葛冻干粉对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:体外培养HUVECs,采用Krebs液建立缺氧/复氧损伤模型。用梓葛冻干粉干预后,采用MTT比色法测定细胞活力、黄嘌呤氧化酶法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性、硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛(MDA)含量、硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)含量、2,4-二硝基苯肼显色法测定细胞外乳酸脱氢酶(LDH)释放量;Western blot法分析细胞凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Caspase-3的表达。结果:与模型组相比,梓葛冻干粉12.5 mg.L-1显著提高细胞活力(P<0.05);梓葛冻干粉49.0,24.5,12.5 mg.L-1均显著提高缺氧/复氧后细胞SOD活性(P<0.05);梓葛冻干粉24.5,12.5 mg.L-1能显著减少LDH的释放量及降低MDA和NO的含量(P<0.05),并上调细胞Bcl-2蛋白表达(P<0.05,P<0.01);梓葛冻干粉49.0,24.5,12.5 mg.L-1显著降低Bax的表达并上调Bcl-2/Bax(P<0.05,P<0.01),且梓葛冻干粉49.0,24.5 mg.L-1显著降低Caspase-3的表达(P<0.01)。结论:梓葛冻干粉可显著拮抗缺氧/复氧对HUVECs的损伤,可能与其抑制细胞过氧化损伤,增强细胞抗氧化和抗凋亡能力有关。

梓葛冻干粉针对大鼠急性脑微循环障碍的改善作用

目的:探讨梓葛冻干粉针对大鼠急性脑微循环障碍的改善作用。方法:大鼠给药14 d后开颅窗,利用高分子葡聚糖复制实验性微循环障碍模型,生物显微镜下观察记录给药后各组大鼠不同时间点软脑膜微动静脉直径,激光多普勒血流仪监测血流量,电阻法测红细胞压积,全自动血液流变仪测流变学指标。结果:梓葛冻干粉针(16.40,32.70,65.40 mg·kg^(-1))能显著扩张软脑膜的微动静脉内径、改善血流量下降的趋势和降低血液流变学各项指标。结论:梓葛冻干粉针具有改善脑部微循环的作用。

梓葛冻干粉针中葛根素在正常大鼠和脑缺血大鼠的药代动力学比较研究

目的对比研究梓葛冻干粉针中葛根素在正常和脑缺血大鼠体内的药动学。方法建立测定大鼠血浆中葛根素的高效液相色谱．质谱联用法，以染料木素为内标，采用DiamonsilC18（4．6mm×150mm，5μm）色谱柱，以甲醇（含0．1％甲酸）-水（含10mmol·L-1醋酸铵）（80：20）为流动相，流速0．6mL·min-1；采用电喷雾离子源负离子模式（ESI-），多反应监测（MRM）方式对葛根素（m／z415．1→295．1）和内标物（m／z269．2→133．1）进行测定。线栓法制备永久性脑缺血模型大鼠，正常和模型大鼠分别尾静脉注射给予梓葛冻干粉针（26．7mg·kg-1），HPLC—MS／MS测定给药后不同时间点（3，5，10，30，60，120，180，300min）血浆中葛根素浓度，数据经DAS2．1软件计算药动学参数并用SPSS软件对数据进行统计学处理。结果血浆中葛根素浓度在0．02～100μg·mL-1内，呈良好线性（r=0．9954）；方法提取回收率大于86．3％，批内与批间精密度（RSD）均小于13．2％，准确度（RE）在-7．3％～10．5％内。正常组血浆中葛根素的实测达峰浓度（ρmax）为（56．5±3．4）μg·mL-1，经-时曲线下面积（AUC0-t）为（17．1±1．5）μg.h.mL-1，半衰期（t1／2）为（0．311±0．133）h，平均滞留时间（MRT0-t）为（0．269±0．044）h；在模型组，ρmax为（62．3±14．0）μg·mL-1，AUC0-t为（20．0±6．8）ng·h·mL-1，t1/2为（0．755±0．128）h，MRT0-t为（0．360±0．045）h。与正常组相比，梓葛冻干粉针中葛根素在模型组血浆中的t1/2、MRT0-t均显著延长（P〈0．05）。结论建立的HPLC—MS／MS方法专属性强、灵敏度高、快速准确，可用于大鼠血浆中葛根素的测定和药动学研究。与正常大鼠相比，梓葛冻干粉针中葛根素在永久性脑缺血模型大鼠的生物利用度提高．消除减慢、滞留时间延长。

梓葛冻干粉针对体外氧糖剥夺/再灌注损伤大鼠大脑皮层星形胶质细胞的保护作用

目的探讨梓葛冻干粉针(C-P)对体外氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤大鼠大脑皮层星形胶质细胞的保护作用及可能的机制。方法原代分离培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞,神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光鉴定星形胶质细胞的纯度。实验分正常组、模型组、辅料组、C-P:12.25、24.50、49.00μg·m L-1组。对星形胶质细胞进行OGD 6h/R 12h损伤并同时给予C-P。噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率、比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡率。利用试剂盒的方法分别检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活性,谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的含量以及一氧化氮(NO)的释放量,ELISA法测定细胞培养液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和前列腺素(PG)E2的含量,Western blot检测细胞内caspase-3,诱导型一氧化氮合酶(i NOS),环氧酶(COX)-2,核因子(NF)-κB p65,p-NF-κB p65,IκB-α,p-IκB-α蛋白表达量。结果原代培养的星形胶质细胞纯度在97%以上。与正常组相比,模型组细胞存活率显著降低,LDH漏出率及细胞凋亡率明显增高;细胞内SOD活性和GSH含量明显降低,MDA和ROS含量显著升高;细胞培养液中NO、TNF-α、IL-1β和PGE2的释放量也显著增加。而以上相关生化指标均可被不同剂量的C-P所抑制。辅料组与模型组无显著差异。进一步研究发现,C-P能显著抑制OGD/R损伤引起的细胞中caspase-3、i NOS、COX-2蛋白表达量及NF-κB p65和IκB-α的磷酸化水平的增高。结论 C-P对体外OGD/R损伤的星形胶质细胞具有保护作用,其保护机制与其抗炎、抗氧化以及抑制细胞凋亡和NF-κB信号通路的激活有关。

梓葛冻干粉针中葛根素在大鼠肝肾的分布

目的:考察梓葛冻干粉针中葛根素在大鼠肝、肾的分布过程,探讨梓葛冻干粉针的安全性。方法:设梓葛冻干粉针药物组和葛根素冻干粉针对照组,按葛根素剂量26.7 mg.kg-1,经大鼠尾静脉给药。采用高效液相色谱法测定给药后5,10,20,30,45,60,120 min,大鼠肝、肾组织中葛根素的浓度。结果:药物组中葛根素在肾脏的峰浓度Cmax为58.12μg.g-1,药-时曲线下面积AUC0-2 h为26.24μg.h.g-1,平均滞留时间MRT0-2 h为0.39 h;对照组中葛根素在肾脏的Cmax71.28μg.g-1,AUC0-2 h35.24μg.h.g-1,MRT0-2 h0.42 h。与对照组相比,药物组大鼠肾脏中的葛根素Cmax和AUC0-2 h明显降低(P<0.05),达峰时间tmax和MRT0-2 h无显著性差异。2组中葛根素在肝脏的tmax,Cmax,AUC0-2 h和MRT0-2 h均无显著性差异。结论:与葛根素冻干粉针相比,梓葛冻干粉针中葛根素在肾脏的分布明显降低,消除无明显变化;在肝脏的分布与消除均无明显变化。说明梓醇可降低葛根素在肾脏中的分布,梓葛冻干粉针比葛根素粉针对于肾脏安全性更高。