蔷薇科植物越冬病残体中梨火疫病菌的检测及致病性分析

为明确梨火疫病在新疆地区发生、流行的初侵染来源,以新疆巴州库尔勒市、轮台县,伊犁地区霍城县、伊宁市采集的6种蔷薇科植物越冬病残体为试材,采用平板分离划线培养、致病性测试、PCR检测和序列分析等方法,检测病残体是否携带梨火疫病菌(Erwinia amylovora)及测定存活力。结果表明,6种寄主的病残体组织均可分离出病原菌,其分离出的病原菌接种在离体叶片上均可致病,通过分子生物学鉴定为梨火疫病菌。6种寄主的病残体(花腐、叶枯、枝枯、果腐、溃疡斑组织)均携带梨火疫病菌,且具有致病性,因此,需及时清除果园中越冬病残体。研究结果为防控梨火疫病的发生和流行提供了理论依据。

梨火疫病菌拮抗菌株组合的亲和力及其防病效果测定

为获得对梨火疫病菌(Erwinia amylovora)抑菌活性高、防病效果好的拮抗菌组合,以实验室前期从香梨酵素液中分离初筛出的E.amylovora拮抗细菌菌株为材料,采用对峙培养法检测菌株之间的亲和性,打孔-抑菌圈法测定复配组合菌株的抑菌活性。对筛选出相容性良好,对E.amylovora抑菌作用强的拮抗细菌组合通过喷施香梨离体花序和盆栽杜梨苗评价其对梨火疫病的防病效果。结果显示:筛选出相容性良好的3个拮抗细菌组合FX1-FJ20、FX74-FN12和FX70-FX43,其复配比例为1∶1的组合菌体发酵液和组合除菌发酵液的抑菌率均达到83%以上,明显高于单一菌株。3个拮抗细菌组合菌体发酵液和组合除菌发酵液对香梨花腐的3~7 d的平均预防型防效分别为56.26%~73.16%和72.02~82.66%;对杜梨苗的7~15 d的预防型防效分别为67.38%~77.73%和71.78%~80.11%,治疗型防效分别为64.53%~75.01%和69.09%~79.03%。组合菌的防效均较单个菌株提高,组合菌除菌发酵液的防效优于组合菌菌体发酵液,预防型防效优于治疗型防效。综合防效试验结果可见,拮抗菌组合FX74-FN12的防效最佳,其菌体发酵液和除菌发酵液对香梨花腐3~7 d的预防型防效分别为73.16%、82.66%,比单菌株的平均防效分别增加12.90%和22.40%;对杜梨苗的7~15 d的平均预防型和治疗型防效分别达到75.00%和79.00%以上,比单菌株的平均防效分别增加15.12%和11.02%,对梨火疫病具有较好的生防潜力。

大蒜素对库尔勒香梨梨火疫病的控害作用及安全性评价

为了明确5%大蒜素对梨火疫病病原菌有无抑制作用并对库尔勒香梨生长进行安全性评价,本试验采用抑菌圈法测定5%大蒜素对梨火疫病病原物的抑制效果,且在库尔勒香梨花期进行田间喷药安全性试验,结果表明:室内毒力测定5%大蒜素对梨火疫病有抑制作用,EC50为37.70 mg/L,温度较高时会产生药害,药害随药剂浓度降低而降低,500倍药害严重,1500倍药害中等,稀释至2500倍时无药害。建议5%大蒜素可作为梨火疫病的杀菌剂使用。但在库尔勒香梨花期使用时,5%大蒜素对其会产生药害,建议一定要严格按照药剂推荐的田间浓度,并要求在早晨或傍晚施药。

菌虫复合技术在梨火疫病疫木生物转化中的应用

林果疫木枝条的无害化处理和资源化利用,是当前农林废弃物处理以及植物疫病防控的难点,也是农业环境科学与植物保护科学交叉研究的新方向。本试验以库尔勒香梨(Pyrus sinkiangensis Yu)梨火疫病疫木为靶标,采用菌-虫(白星花金龟,Protaetia brevitarsis)联合,开展菌剂、牛粪香梨枝条配比、酵化时间的三因素五水平正交试验,明确疫木发酵关键技术参数,以及白星花金龟最佳取食组合。试验结果表明,5种腐解菌+牛粪处理最高发酵温度均已超过55℃,其中EM菌剂腐解效果最好,LK菌剂次之。发酵产物经菌虫复合转化12 d后,幼虫质量增加5.32~8.38 g,虫砂量可达36.93~83.55 g,虫砂转化率最高可达94.26%。综合考虑降低牛粪添加比例、酵化时间及物料处理成本,LK菌剂、添加40%的牛粪及酵化25 d为白星花金龟幼虫最佳取食组合方案,且发酵产物以及白星花金龟转化产物虫体和虫砂中均未检测出梨火疫病菌(Erwinia amylovora)。研究表明,微生物与白星花金龟相结合对香梨疫木枝条有较好的转化率,通过白星花金龟实现了疫木枝条的资源化利用,且阻断了疫木枝条传播病源的途径。

梨火疫病菌对四霉素敏感基线的建立及抗药性评价

【目的】建立新疆库尔勒地区和阿克苏地区梨火疫病菌(Erwinia amylovora)对四霉素的敏感基线,监测梨火疫病菌对四霉素的抗药性水平,为四霉素防治梨火疫病田间用药、抗药性监测与抗药性治理提供理论依据。【方法】采用抑菌圈法测定100株梨火疫病菌株对四霉素的敏感性;采用平板划线法和含药培养基法药剂驯化抗药突变体,进行抗药性评价。【结果】共监测到敏感菌株74个,低抗菌株26个。100株菌株对四霉素的敏感性频率接近正态分布,因此可将该曲线(平均EC50=1.59±1.029μg·mL^(-1))作为新疆库尔勒地区和阿克苏地区梨火疫病菌对四霉素的敏感基线;共获得4株抗药突变体,均不具有稳定遗传性;四霉素与84%噻霉酮、中生菌素均会产生交互抗药性。【结论】建立了新疆梨火疫病菌分离菌株对四霉素药剂的敏感基线,仅监测到少数低抗菌株,梨火疫病菌对四霉素的抗性风险低。

梨园气溶胶中梨火疫病菌的定量检测

为系统研究梨园气溶胶中梨火疫病菌的含量,本研究于2019年-2021年在新疆库尔勒市人和农场梨园,利用病原菌孢子捕捉器在每年春季(4月下旬)、夏季(6月中旬)、秋季(9月中旬)收集梨园气溶胶,检测梨火疫病菌。结果显示,健康梨园气溶胶中未检测到梨火疫病菌,不同发病程度的梨园气溶胶中均能检测到梨火疫病菌,携菌量均值在102 cfu/(24cm^(2)·h)以上,其中,气溶胶中梨火疫病菌含量最高值为2.81×10^(4) cfu/(24cm^(2)·h),最低值为8.50×10^(2) cfu/(24cm^(2)·h);重度、中度、轻度发病果园收集的气溶胶中含梨火疫病菌总菌落数均值分别为8.74×10^(3)、4.55×10^(3)、2.36×10^(3) cfu/(24cm^(2)·h)。此外,在同一高度收集的气溶胶中,梨火疫病菌菌落数随收集时间的延长而增加。不同季节气溶胶携菌量检测结果表明,秋季发病梨园中气溶胶携菌量明显高于夏季和春季,与梨园梨火疫病发病规律相符。致病性测定结果表明,气溶胶中分离的梨火疫病菌具有致病性。

土壤中梨火疫病菌实时荧光定量PCR检测及动态分析

【目的】利用实时荧光定量PCR检测土壤中梨火疫病菌(Erwinia amylovora)浓度,明确梨火疫病菌在土壤中的动态变化规律。【方法】2021年3—11月采集库尔勒市发病香梨园810份土壤样品,应用所建立的实时荧光定量PCR检测体系,测定土壤中的梨火疫病菌浓度,同时对梨园发病率及病情指数进行调查。【结果】土壤中梨火疫病菌浓度值变化趋势与梨园病情指数变化趋势一致,4—5月梨园病情指数快速升高至最高值,随着果树生长期延长,病情指数逐渐降低。土壤中梨火疫病菌浓度值从4月逐渐升高,6月平均浓度值为914 CFU·g^(-1),7月平均浓度值最高为965 CFU·g^(-1),随后逐渐降低;6月土壤带菌率为42.2%,浓度值≥10^(3)CFU·g^(-1)的土样13份;7月土壤带菌率为44.4%,浓度值≥10^(3)CFU·g^(-1)的土样26份;6月、7月土壤中梨火疫病菌浓度显著高于4月、10月、11月,致病风险较高。【结论】6月和7月土壤中梨火疫病菌浓度值最高,主要与4月、5月大量病花病果掉落造成病原菌积累有关。加强花期病害防治和梨园病残体清理可有效降低土壤中梨火疫病菌浓度,是降低梨火疫病菌在梨树根部侵染风险的关键点。

梨火疫病菌在库尔勒香梨枝条中的侵染定殖和扩展特征研究

【目的】示踪梨火疫病菌Erwinia amylovora在库尔勒香梨(Pyrus sinkiangensis Yu)(简称香梨)枝条组织中侵染定殖和扩展特征,为梨火疫病的有效防治提供依据。【方法】以分离获得梨火疫病强致病力菌株E.a001为材料,采用热激法将携带有绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)质粒phc60-gfp转化E.a001,获得了能发出强烈绿色荧光的标记菌株E.a001-gfp。利用该标记菌株接种香梨枝条,检测、观察其在香梨枝条组织中的侵染定殖和扩展动态。【结果】针刺接种和喷雾接种E.a001-gfp引起枝条发病的最低浓度分别为106cfu·mL^(-1)和107cfu·mL^(-1)。相同浓度的病原菌接种,喷雾接种较针刺接种后发病显症时间延迟2~3 d。梨火疫病菌侵染枝条产生的坏死病斑的扩展速率随病原菌浓度提高而升高;病菌在1年生枝条上的生长扩展速度显著快于在2年生枝条内的扩展速度。梨火疫病菌入侵后主要存在于枝条维管系统中,大量分布于皮层薄壁细胞和韧皮部薄壁细胞间隙,少量存在于木质部导管中。在香梨发病枝条上,病健交界处的活菌数量最高,可达到108cfu·g^(-1),未显症部位0~10 cm处病原菌为105cfu·g^(-1),但在香梨枝条病斑外未显症部位10~15 cm处均未分离出病原菌。【结论】研究明确了梨火疫病菌在香梨枝条组织中的扩展距离、迁移时间及速率,以及分布及定殖量,为病枝的准确修剪和制定病害的综合防控措施提供了科学依据。

新疆山楂种质资源对梨火疫病的抗性鉴定与评价

以新疆地区5种山楂种质资源为试材,采用离体叶片法、离体枝条法和离体幼果法,研究了5种山楂资源在实验室内人工接种对梨火疫病菌的抗病性鉴定评价的影响,以期为今后新疆地区城市街道山楂绿化树品种的选择以及山楂种质资源选育抗梨火疫病的品种和防治提供参考依据。结果表明:5种山楂资源的叶片、枝条和幼果在相同时间内对梨火疫病菌的侵染表现出不同程度的感病性,中度感病品种为红果山楂、裂叶山楂、准噶尔山楂,高度感病品种为黄果山楂(阿勒泰山楂)、食用山楂。

20个苹果品种(类型)对梨火疫病菌的抗病性评价

据《植物检疫》2022年第4期《20个苹果品种(类型)对梨火疫病菌的抗病性评价》(作者李晓妹等)报道,为评价梨火疫病菌的致病力及国内不同苹果品种(类型)的抗病性,对供试的20个苹果品种(类型)采用离体枝条和离体叶片针刺接种的方法。

梨火疫病菌的实时荧光PCR检测

根据梨火疫病菌16S^23S间的ITS保守序列,设计并合成了一对特异性引物REA/FEA,应用荧光染料SYBRG reen I,对10个梨火疫的菌株和其它相关参试菌株进行了检测。结果表明,10个梨火疫菌株都产生荧光信号而其它参试菌株都不产生荧光信号,成功建立了梨火疫病菌的实时荧光PCR检测方法。整个检测过程只需3 h,完全闭管,降低了污染的机会,无需PCR后处理。检测的灵敏度是4个菌体细胞,比常规PCR电泳检测提高了10倍。用该特异性引物对梨枝条浸泡液进行实时荧光PCR检测,结果可特异性检测到目标菌的存在,并且检测的灵敏度是24个菌体细胞,比常规PCR电泳检测提高10倍。

梨火疫病菌在中国的潜在分布及入侵风险分析

【目的】细菌性梨火疫病最早发生在北美洲,随着水果贸易等人为因素向世界其它地区传播。对当地的生物多样性和经济带来了极其严重的威胁,亟需对其在中国的适生区进行预测。【方法】苹果开花期的温度和降水量是影响梨火疫病菌适生分布的关键气候因子,本研究根据这一生物学特性及生态环境因子,应用地理信息系统分析得出了梨火疫病在中国两个苹果优势产区的潜在定殖区域。【结果】用该方法对梨火疫病在欧洲的发生情况的预测结果与其历史分布记录相符,使用相同的空间建模方法对梨火疫病在渤海湾和黄土高原两个苹果优势栽培产区的潜在定殖区域进行风险评估,结果表明这两大苹果产区中优先扶持的县大多处于梨火疫病发生的高风险范围。【结论】梨火疫病在中国的大部分地区适生,在有适宜寄主分布的地区,就可能严重发生。

梨火疫细菌实时荧光PCR和诱捕PCR-ELISA检测方法的建立

根据梨火疫细菌中独特而保守存在的质粒pEA2 9,设计了 1对引物和 3条探针 ,建立了实时荧光PCR检测方法和诱捕PCR ELISA检测方法。实时荧光PCR采用带荧光标记的核酸杂交探针 ,边扩增边检测 ,步骤简单 ,不需PCR后处理 ,可避免假阳性和交叉污染 ;诱捕PCR ELISA检测方法只需简单处理的样品就能检测 ,减少了核酸不纯出现的漏检 ,由于增加了核酸杂交探针 ,可不需凝胶电泳EB染色检测 ,不会出现假阳性问题。

利用间接免疫荧光染色和协同凝集技术检测梨火疫病菌

提取梨火疫病菌 (0 0 5 6菌株 )的脂多糖免疫家兔 ,获得抗血清 ,建立了检测梨火疫病菌的间接免疫荧光染色和协同凝集检测技术 ,对梨火疫病菌的不同菌株和人工接种发病样品实施了检测。结果表明 ,这 2种方法可以准确、灵敏地检测梨火疫病菌及样品 ,方法简单、快速、实用 ,可以在中国口岸推广使用 ,减少梨火疫病进入中国的风险。

免疫吸附PCR技术提高梨火疫病菌检测灵敏度

本研究采用已经发表的引物和制备的梨火疫病菌抗血清,研制了免疫吸附-PCR技术,使其检测梨火疫病菌纯菌的灵敏度比标准PCR技术提高10倍;检测模拟样品中的梨火疫病菌灵敏度提高了1000倍;从相关混合菌液中能够更加灵敏和准确地检测出梨火疫病菌。该方法简单易行,准确灵敏,具有广阔的应用前景。

应用聚合酶链反应技术检测梨火疫菌的研究

应用梨火疫菌ＰＣＲ技术可以准确，快速地检测出梨火疫菌潜伏侵染的样品，检出样品中梨火疫菌的最低带菌量为５０个细菌，未发现它与其它植病细菌有交叉反应，从ＰＣＲ扩增、电泳分离到获得最后结果仅需８小时。此法适宜对进口苗木、接穗和水果上的梨火疫菌快速检疫和对引种苗圃和果园里梨火疫病发生进行监测。

检测梨火疫病菌的过敏性寄主

梨火疫病（ＦｉｒｅＢｌｉｇｈｔ）是梨、苹果及许多蔷薇科植物上一种毁灭性的细菌病害，也是我国进境植物应检疫的危险性病害之一。植物病原假单胞菌的过敏反应测定通常在烟草和蕃茄上进行，稻白叶枯病菌的过敏性反应测定还可在蚕豆叶上进行［１］，１９７３年Ｌａｉ和Ｈ...

梨火疫病菌新的Ⅲ型泌出系统(T3SS)分析及在其他菌株中的分布

试验分析了梨火疫病菌(Erwinia amylovora)Ea273基因组上新的T3SS(TypeⅢSecretion System,T3SS)致病岛特征并验证它们在Erwinia属的21个菌株基因组上是否存在。生物信息学分析发现,Ea273基因组不同位点上存在两个新的T3SS致病岛,称为PAI-2和PAI-3,大小分别为32.889kb和21.792kb。经PCR和Southern blot证明Ea273、Ea246、Ea262、Ea528以及Ea6445个菌株基因组存在PAI-2和PAI-3。PAI-3和PAI-2在基因结构和组成上相似,同源性超过70%,PAI-3包含PAI-2所有基因,两者和昆虫内生菌S.glossinidius编码的T3SS的SSR-1致病岛非常相似。

梨火疫病菌活菌快速定量检测方法的建立

【目的】将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量PCR技术(qPCR)相结合,建立一种快速检测梨火疫病菌活菌的方法,为病害的检疫和早期诊断,开展病原学、流行规律研究及制定科学防控措施严防病害入侵提供技术支持。【方法】以梨火疫病菌(Erwinia amylovora)质粒pEA29设计特异性引物EaP29F1/EaP29R1,通过优化PMA的质量浓度和曝光时间,确定区分梨火疫病菌死活菌的PMA预处理最优反应条件,再以活菌DNA为模板进行qPCR的特异性扩增。设置不同比例死活菌混合体系,验证PMA-qPCR反应的可靠性。【结果】当梨火疫病菌浓度为1×10^8 CFU·mL^-1、PMA浓度为25μmol·L^-1、曝光时间为10 min时,能完全抑制死菌的扩增,仅以活菌体DNA为靶标进行选择性扩增。当活菌比例为10%~100%时(浓度为6.0×10^7~6.0×10^8 CFU·mL^-1),PMA-qPCR测得的活菌数与理论活菌数值均在同一个数量级,二者存在良好的线性关系(R^2=0.9928)。灵敏度检测结果表明,6.0×10^3~6.0×10^8 CFU·mL^-1范围内,梨火疫病菌活菌数与Ct值线性相关(R^2=0.9947),检测灵敏度下限为6×10^3 CFU·mL^-1(12 CFU/qPCR反应)。用建立的PMAqPCR方法检测人工接种发病的香梨、苹果、杜梨枝条,PMA-qPCR能准确检测其中的活菌,结果与菌落计数结果相符。【结论】本研究建立的PMA-qPCR检测方法能定量检测梨火疫病菌病活菌数量,具有灵敏、准确和高效的优点,避免了常规qPCR检测死菌导致的“假阳性”。

免疫捕获PCR检测进境苹果果实中梨火疫病菌

利用梨火疫病菌抗体和PCR技术建立了梨火疫病菌免疫捕获PCR方法,检测苹果模拟样品的灵敏度达到了1.5×102cfu/reaction。与直接PCR进行比较,免疫捕获PCR方法检测苹果模拟样品的灵敏度提高了10倍以上,而且省去了DNA提取等步骤。利用该方法成功从进境苹果样品中检测到梨火疫病菌,产物测序结果表明,产物序列和梨火疫病菌的相应序列高度一致。试验结果表明,免疫捕获PCR法能除去样品中的大部分PCR反应抑制物质,可以有效检测进境苹果中梨火疫病菌,在口岸水果检疫中具有一定的应用潜力和推广价值。