酶联荧光免疫分析技术检测粪便中艰难梭菌毒素A/B

目的应用酶联荧光免疫分析(ELFIA)技术及PCR联合检测粪便标本中艰难梭菌毒素A/B(CDAB),分析不同临床表现的住院患者粪便标本中CDAB的检出情况。方法收集北京大学第一医院2010年8月～11月242位住院患者粪便标本,用ELFIA法检测CDAB,对检测结果为可疑的标本用PCR复测。将患者分为非抗生素相关腹泻组和抗生素相关腹泻组,对两组的CDAB阳性率进行χ2检验,并分析检测结果与临床表现的相关性。结果 242位患者中,22例ELFIA法CDAB检测为阳性,12例检测结果为可疑。12例可疑标本有10例进行了PCR复测,8例(80.0%)CDAB基因阳性。两法联合检测共计30例为CDAB阳性,阳性率为12.4%。抗生素相关腹泻组CDAB阳性率(24.0%)显著高于非抗生素相关腹泻组(6.9%)(χ2=14.21,P<0.01)。CDAB阳性组的年龄(68.2±23.6)岁高于CDAB阴性组(58.7±23.9)岁(P<0.05)。结论 ELFIA法检测CDAB,有商品试剂盒,方法简便可靠。可疑阳性标本用PCR法检测tcdA/tcdB基因,可进一步提高阳性率。艰难梭菌毒素在抗生素相关腹泻患者检出率较高,与临床表现具有较好的相关性。

艰难梭菌毒素A对K562细胞生长增殖的影响

本研究探讨艰难梭菌毒素A(Tcd A)对人慢性髓系白血病(CML)细胞株K562生长增殖的影响及其机制。采用四氮唑蓝比色法(MTT法)观察Tcd A对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞术分析细胞周期及线粒体膜电位的变化;免疫细胞化学法观察细胞色素C蛋白的表达水平;DNA凝胶电泳技术检测细胞凋亡。结果表明,不同浓度的Tcd A明显抑制K562细胞增殖,呈一定的时间和浓度依赖性;流式细胞仪检测显示,细胞阻滞于G0/G1期,并出现凋亡峰,细胞内细胞色素C蛋白含量增高;DNA凝胶电泳出现片段化的梯形带。结论:Tcd A可以抑制K562细胞的生长增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与线粒体膜电位降低,基质中释放出致凋亡活性物质细胞色素C有关。

艰难梭菌毒素A诱导K562细胞凋亡及其机制研究

本研究探索艰难梭菌毒素A(Tcd A)对人慢性髓系白血病细胞株K562细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。采用MTT法检测Tcd A的细胞毒作用,用Hoechst33342染色和流式细胞术观察细胞凋亡,免疫细胞化学法检测BCL-2、BAX蛋白表达水平,比色法检测caspase-3活性。结果表明,Tcd A能明显抑制K562细胞增殖,具有浓度和时间依赖性;荧光染色和流式细胞术检测到细胞凋亡;Tcd A作用后BCL-2蛋白表达下降,而BAX蛋白表达明显增加,与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05);caspase-3活性增强,差异有统计学意义(p<0.05)。结论 :Tcd A能明显抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与上调BAX蛋白表达,激活caspase-3有关。

艰难梭菌毒素A对K562细胞Rho GTPases及细胞骨架的影响

目的:研究艰难梭菌毒素A(TcdA)对白血病K562细胞株Rho GTPase及细胞骨架的影响。方法:体外培养K562细胞经不同浓度的TcdA处理,采用四唑蓝比色试验(MTT)检测TcdA对K562细胞增殖的影响;RT-PCR法检测TcdA作用后细胞骨架调节蛋白相关基因cdc42、RhoA、Rac1 mRNA表达的变化;激光共聚焦显微镜观察TcdA作用48h后细胞微丝的变化。结果:TcdA能抑制K562细胞的增殖,作用48h后的抑制率(IR)为47.67%,TcdA可下调细胞骨架调节蛋白相关基因cdc42、RhoA、Rac1 mRNA表达,与对照组相比差异具有统计学意义(P <0.05)。激光共聚焦显微镜显示,TcdA处理后细胞内微丝含量下降。结论:艰难梭菌毒素A可抑制白血病细胞株K562增殖,其作用机制可能与Rho GTPase通路蛋白相关基因的表达下降,微丝形成受抑相关。

艰难梭菌毒素A/B、BD-PCR毒素基因及GDH检测对艰难梭菌相关性腹泻的诊断价值

目的探讨艰难梭菌毒素A/B及其相关毒素基因检测对艰难梭菌相关性腹泻的诊断价值。方法收集2015年1月至2015年10月我院ICU病房腹泻疑似艰难梭菌感染患者的粪便标本133例作为研究对象,分别采用艰难梭菌培养法、CDAB法、PCR毒素基因检测法及艰难梭菌毒素GDH检测法进行检测,以艰难梭菌培养法结果为金标准,计算各方法的诊断指标所包含有的特异度、敏感度、阴性预测值和阳性预测值等。结果本研究收集的133例粪便标本中,经过金标准粪便样本厌氧培养法检出阳性结果 20例,阴性结果 113例。CDAB法具有低敏感度(0.550)和高特异度(0.912),诊断符合率为0.932,BD-PCR毒素基因检测法具有高敏感度(0.950)和高特异度(0.929),诊断符合率为0.932,艰难梭菌毒素GDH检测法的高敏感度(0.900)和低特异度(0.779),诊断符合率为0.797。结论对于疑似艰难梭菌感染,可联合艰难梭菌GDH、艰难梭菌毒素A/B(CDAB)或进行荧光定量PCR毒素基因共同检测,有效降低检测时间,为临床医师及时提供准确的诊断依据,并制定行之有效的治疗措施。

艰难梭菌毒素A诱导结肠癌SW480细胞线粒体凋亡途径的研究

目的:探讨艰难梭菌毒素A(Tcd A)对结肠癌细胞株SW480增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法:采用四唑蓝比色法(MTT)检测Tcd A对SW480细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡情况和线粒体膜电位的变化;PI细胞荧光双染色法观察细胞凋亡的形态学变化。结果:Tcd A能显著抑制SW480细胞的增殖,且抑制率呈浓度依赖性;流式细胞仪分析处理组SW480细胞出现明显的凋亡以及线粒体膜电位的降低;细胞荧光染色观察到典型的凋亡形态学变化。结论:Tcd A可诱导SW480细胞发生凋亡,其机制可能是通过诱导线粒体膜电位的下降,破坏其外膜结构而诱发的。

艰难梭菌毒素A对白血病细胞株K562增殖、凋亡及相关基因调控的研究

目的探讨艰难梭菌毒素A(TcdA)对白血病细胞株K562增殖、凋亡的作用及其机制。方法采用四唑蓝比色试验(MTT)检测TcdA对K562细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡情况;RT-PCR法检测TcdA作用后细胞Bcl-2/Bax,Egr-1mRNA表达的变化。结果 TcdA能抑制K562细胞的增殖,作用48h后的抑制率(IR)为47.67%,流式细胞仪分析出现典型的亚二倍体峰(凋亡峰)。TcdA作用后K562细胞Bcl-2基因表达下调,Bax基因表达上调,而Egr-1基因表达上调,并呈量效关系。结论艰难梭菌毒素A可诱导K562细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2,上调Bax,上调Egr-1基因表达水平有关。

艰难梭菌毒素A＆B测定在医院腹泻患者中的应用价值研究

目的研究艰难梭菌毒素A＆B（CDAB）测定在医院腹泻患者中的应用价值。方法 54例住院后出现腹泻的患者,均采取CDAB检测试剂与VIDAS分析仪进行粪便标本的毒素检测,结合患者的临床资料、治疗情况及细菌常规培养结果进行综合性分析。结果 54例患者经检测后,有9例患者检测出艰难菌毒素阳性,并且检测结果均与患者的临床诊治相符。9例CDAB阳性患者中,2例为神经外科患者、2例为风湿科患者、2例为肿瘤科患者、2例为脊柱外科患者、1例为儿科患儿,其年龄10~64岁,TV值为0.53~3.98。结论对腹泻患者进行艰难梭菌毒素A＆B测定具有重要的临床价值,CDAB检测试剂与VIDAS分析仪检测操作简单便捷、检测结果准确且快速,值得临床推广。

艰难梭菌毒素A适配子的筛选和鉴定

目的筛选和鉴定艰难梭菌(Cd)毒素A(TcdA)适配子(Apt)。方法体外合成80bp的单链DNA(ssDNA)随机文库,采用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选TcdA的核酸适配子。使用DNA MAN5.2.2.0软件和mfold软件对筛选出的适配子序列的同源性和二级结构进行分析,并采用非竞争酶联免疫吸附试验测定其亲和常数。结果经过12轮筛选,文库中随机ssDNA与TcdA的结合率从1.4%增加到44.6%,筛选出来50条适配子,二级结构最稳定的是Apt-A22,其亲和常数为2.25×107 M-1。结论采用SELEX技术成功筛选出高亲和力的TcdA适配子,为临床Cd感染的诊断和治疗提供参考依具。

台山地区艰难梭菌毒素A/B检测在院外和院内感染的临床应用

目的探讨艰难梭菌毒素A/B检测在台山地区院外和院内感染中的应用。方法收集2013年5月~2014年10月528例刚入院腹泻患者的粪便标本作为院外感染可疑病例组（院外感染组）,年龄段在8~75岁,男249例,女279例;收集同时间段523例住院超一周以上并使用抗生素3天以上的患者的粪便标本作为院内感染的可疑病例组（院内感染组）,年龄段在7~74岁,男209例,女314例。分别进行艰难梭菌毒素A/B检测,并结合细菌培养结果、临床诊断和疗效进行综合统计学分析。结果院外感染艰难梭菌率4%,院内使用抗生素后感染率16%。艰难梭菌毒素A/B检测对院外感染的检出率为85%,对院内感染的检出率为90%。结论艰难梭菌毒素A/B检测对台山地区院外和院内感染检测快速准确,值得在临床上推广应用。

艰难梭菌A毒素对食管癌干细胞损伤的研究

目的通过单细胞凝胶电泳(SCGE)和细胞荧光染色技术,研究艰难梭菌毒素A(TcdA)对食管癌干细胞(SP细胞)的杀伤力,探讨其应用价值。方法食管癌干细胞台盼蓝染色检测后,采用单细胞凝胶电泳技术检测TcdA对食管癌干细胞DNA损伤情况;同时通过细胞荧光染色技术研究TcdA作用后的食管癌干细胞发生凋亡的形态学改变。结果 400 ng/mL TcdA作用食管癌干细胞后;细胞DNA被破坏,单细胞凝胶电泳后细胞"彗尾"长度明显增加,荧光强度变大;细胞荧光染色发现实验组的细胞碎裂伴凋亡小体形成。结论 TcdA对食管癌干细胞DNA的损伤及诱发凋亡的特性,可能为食管癌的治疗带来新的希望。

艰难梭菌毒素AC端结构域在大肠杆菌中的可溶性表达与卵黄抗体的制备

目的重组表达艰难梭菌毒素A的C端结构域,制备针对艰难梭菌毒素A C端结构域的卵黄抗体。方法将优化合成的艰难梭菌毒素A的C端结构域DNA片段克隆到表达载体pET32b(+)上,重组质粒转入大肠杆菌中诱导表达,经高亲和镍离子树脂纯化得到融合蛋白,凝血酶酶切后用高亲和镍离子树脂吸附多余多肽获得目的蛋白。检测目的蛋白的生物学活性,用目的蛋白免疫产蛋鸡制备针对艰难梭菌毒素A受体结合区的鸡卵黄抗体,分离纯化鸡卵黄抗体并用ELISA测定卵黄抗体的效价。结果获得了优化的艰难梭菌毒素A受体结合区的基因片段,继而制备了具有生物学活性的毒素A C端结构域重组蛋白。免疫产蛋鸡后获得了效价1∶50 000的抗艰难梭菌毒素A的卵黄抗体。结论获得了具有生物学活性的艰难梭菌毒素A C端结构域重组蛋白,为建立艰难梭菌基因工程疫苗打下了基础,并制备了针对艰难梭菌毒素蛋白A的卵黄抗体,可用于艰难梭菌相关性腹泻的诊断和治疗。

艰难梭菌毒素A对胆管癌细胞株FRH-0201增殖和凋亡的影响

目的:研究艰难梭菌毒素A(TcdA)对人胆管癌细胞株FRH-0201细胞凋亡影响及作用机制。方法:采用MTT法检测细胞增殖抑制率,荧光染色检测TcdA作用后细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫细胞化学法检测Bcl-2表达水平,Caspase3活性检测试剂盒检测Caspase-3的活性。结果:TcdA能抑制胆管癌细胞株FRH-0201细胞增殖且呈时间、剂量依赖性,荧光染色和流式细胞仪检测到细胞凋亡,与对照组相比,TcdA作用后Bcl-2蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),Caspase-3活性增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TcdA可以通过下调Bcl-2蛋白表达表达,激活Caspase-3而诱导FRH-0201细胞凋亡。

艰难梭菌毒素A原核表达及重组蛋白纯化

目的构建艰难梭菌(Clostridium difficile,C.difficile)毒素A羧基末端原核表达载体,优化诱导表达条件及纯化重组蛋白。方法利用聚合酶链式反应扩增C.difficile毒素A羧基末端基因序列,并将此序列转入pET-28b载体,构建pET-28b-tcdA重组表达载体,并将表达载体转化到BL21(DE3)感受态大肠埃希菌细胞中,分别在不同条件下进行诱导表达,获得最佳诱导表达条件后进行大量表达,最后用Ni柱对重组蛋白进行亲和纯化,得到纯化后的重组蛋白。结果成功构建了pET-28b-tcdA重组表达载体,其重组蛋白表达最佳诱导条件:菌液吸光度值取0.6、温度取25℃、IPTG终浓度取1.0mmol/L、诱导时间取10h。蛋白纯化咪唑磷酸盐洗脱液最佳浓度取200mmol/L。结论成功构建pET-28b-tcdA重组表达载体,在大肠埃希菌BL21(DE3)中可以有效表达,并获得高浓度重组蛋白,为进一步制备TcdA适配子奠定了一定实验室基础。

C型肉毒梭菌毒素防制布氏田鼠的试验

C型肉毒梭菌毒素用于灭鼠的时间不长,仅对几种常见鼠作了防治试验,取得了较好效果。1989年9月,用江苏商业专科学校研制的C型肉毒梭菌毒素,对布氏田鼠作了现场防治试验。每克诱饵含2.0万、4.0万和8.0万以及1.0万单位冻干毒素,灭鼠效果分别为97.96±1.77%、100%、90.4±1.11%和75.58±5.83%;每克诱饵含1.0万单位和2.0万单位水溶液毒素,灭鼠效果分别为99.74±0.51%和99.02±1.10%。该毒素能在常温下运输和使用,是一种很有实用价值的新型杀鼠剂。

艰难梭菌A毒素诱导SMMC7721细胞和Vero细胞凋亡的比较研究(英文)

背景与目的:艰难梭菌是假膜性大肠炎及抗生素诱发性腹泻的主要致病菌之一,它产生的毒素具有不同的生物学活性。本实验拟研究艰难梭菌A毒素诱导人肝癌细胞株(SMMC7721)和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)凋亡的作用。方法:由脑心浸液对艰难梭菌VPI10463菌株培养产毒,经甲状腺球蛋白亲合层析和QSephrose层析提纯得到精制A毒素。对SMMC7721细胞的研究以Vero细胞为对照。抑制细胞增殖的检测采用MTT法;用荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞仪观察细胞形态和细胞周期的改变;采用琼脂糖凝胶电泳法观测DNA碎片。结果:不同浓度A毒素(0.293～4.690mg·L-1)明显抑制了SMMC7721及Vero细胞的增殖,并且呈时间和浓度依赖性;两种细胞与A毒素共同培养48h,荧光显微镜和透射电镜都观察到典型的凋亡形态变化;SMMC7721细胞与A毒素共同培养48h后,琼脂糖凝胶电泳显示梯形条带。结论:A毒素明显诱导了两种细胞的凋亡;A毒素对SMMC7721细胞具有更强的诱导凋亡作用。

C型肉毒梭菌毒素对非靶动物的一次和二次中毒的实验研究

为有效控制鼠害，又不危及天敌的生存、保护生态环境，笔者应用Ｃ型肉毒梭菌毒素，进行了对非靶动物的一次和二次中毒的实验研究。１材料１１实验动物小白鼠，从兰州生物制品研究所引种，自繁自养；高原鼠兔及黄鼬，捕于甘南玛曲县黄河沿岸鼠害区；狗、猫，购于平凉市场...

C型肉毒梭菌毒素应用于旅游点现场的灭鼠试验

笔者于１９９２年６月，在高气温（室外２３～３３．５℃、室内２０～２９℃）条件下，用Ｃ型肉毒梭菌毒素在北方某市两个旅游点进行灭鼠试验，灭效分别为９３．３５％和１００％。基饵为大米，毒素含量为３０００ＭＬＤ／ｇ。国内尚未见同类报道。

运用压电石英晶体生物传感器检测产气荚膜梭菌α毒素的实验研究

目的研究运用压电石英晶体生物传感器对产气荚膜梭菌α毒素(CPα)进行检测的方法和反应条件。方法按照碱基配对的原则,设计特异的产气荚膜梭菌α毒素基因寡核苷酸探针并利用巯基自组装技术固定在石英晶体上,运用压电石英晶体生物传感器的"质量效应"对聚合酶链反应(PCR)扩增得到的产气荚膜梭菌α毒素靶基因进行杂交检测,并探讨不同pH值和不同离子强度的缓冲液对检测的影响。结果压电石英晶体生物传感器成功检测出产气荚膜梭菌α毒素;pH7.6的缓冲液和0.64mol/L的NaCl溶液最适合于检测。结论压电石英晶体生物传感器能够有效地检测产气荚膜梭菌α毒素,有望对临床上开展毒素诊断提供一种新的手段。

产气荚膜梭菌ε毒素突变基因的表达及其抗体中和效价测定

为研究突变产气荚膜梭菌ε毒素(mε)的抗体是否具有中和作用,本研究以毒素D型产气荚膜梭菌全基因组D N A为模板,应用重叠延伸PCR技术(SO E-PCR)将ε毒素第106位的组氨酸残基定点突变为脯氨酸残基,扩增出mε基因,使其丧失生物学毒性而保持免疫原性。以pET-28a为表达载体,构建重组表达质粒pET-mε,并转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达重组mε蛋白。SDS-PAGE及w estern blot分析显示,重组蛋白约39 ku,主要以包涵体形式存在。将重组蛋白免疫家兔,所制备的产气荚膜梭菌mε毒素蛋白的抗血清经10倍稀释后,与一个绝对致死量的产气荚膜梭菌培养上清等体积混合时,能够有效中和ε毒素。这些结果表明,重组突变的ε毒素具有较强的抗原性,为产气荚膜梭菌候选亚单位疫苗的研究及其血清学检测方法的建立奠定了基础。