梯型熔解温度等温扩增检测食品中植物源成分的内标方法构建

目的为梯型熔解温度核酸等温扩增(ladder-type melting temperature isothermal amplification,LMTIA)检测食品中植物源特异性基因建立内标方法,并用于检测肉制品中植物成分。方法针对植物转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)的共有序列,设计LMTIA引物,优化反应温度,考查方法灵敏度,并评估淀粉制品、蜂蜜、食用油DNA提取方法与LMTIA检测方法的适应性,以H_(2)O、鸭肉、鸡肉、羊肉、猪肉和牛肉基因组为阴性对照测试LMTIA方法的假阳性。结果所建立的LMTIA方法在最优温度57℃时,灵敏度为10 pg/μL玉米基因组与10 pg/μL红枣基因组,可检出肉制品掺入0.1%的玉米淀粉,所选淀粉制品、蜂蜜、食用油DNA提取方法均适用于LMTIA检测,并且所有阴性对照样品在测试中均未出现假阳性。结论本研究成功建立了LMTIA检测食品中植物源特异性基因的内标方法,排除了DNA提取引起的LMTIA检测的假阴性,可用于肉制品中植物成分定性检测。

我校梯型熔解温度等温扩增技术应用研究新进展

梯型熔解温度等温扩增(LMTIA)技术是许昌学院王德国教授课题组研究开发的国际前沿核酸检测技术,在国际期刊BioTechniques上刊出后,该课题组在LMTIA的应用研究领域取得重要进展。构建了LMTIA检测食品中植物源成分的内标方法,启动了淀粉基食品LMTIA掺假检测研究,并建立了红薯粉条掺假木薯粉的LMTIA检测方法。

肉制品中猪肉源成分的Proofman-梯型熔解温度等温扩增检测

建立一种基于Proofman探针(proofreading enzyme-mediated probe cleavage)的梯型熔解温度等温扩增(ladder-shape melting temperature isothermal amplification,LMTIA)方法检测肉制品中的猪肉成分。选取猪细胞核中的特异性基因PRLR为靶基因,设计LMTIA引物和Proofman探针。通过优化反应体系,对所建立的方法进行特异性、灵敏度和最低检测限结果评价。结果表明:所建立的Proofman-LMTIA方法可在30 min内完成检测;相对于从鸡肉、鸭肉、牛肉、羊肉、猫肉、狗肉、玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、绿豆淀粉、小麦粉中提取的基因组DNA,可特异性检测猪基因组DNA;检测灵敏度为1 ng/μL,对人工模拟的混合肉样中猪肉的最低检测限为0.1%。所建立的Proofman-LMTIA方法对猪肉成分有较好的特异性,能够快速、准确检测出肉制品中的猪肉成分,可对猪肉掺假进行快速检测。

梯型熔解温度等温扩增检测羊肉源基因研究

利用建立梯型熔解温度等温扩增技术(ladder-type melting temperature isothermal amplification,LMTIA)建立肉及肉制品中羊肉源基因成分的检测方法、针对羊肉特异性基因设计特异性引物,优化反应温度,测试灵敏度、特异性,以及羊肉含量的定量检测.所建立的方法在反应温度55℃条件下,引物特异性最强,羊肉DNA的最低检测限为1 ng/μL,可检测质量百分比为0.1%的羊肉成分的存在.该方法具有操作便捷、特异性强等优势,适用于羊肉掺假及羊肉含量的快速检测.

核酸等温扩增技术检测动物源食品研究进展

综述了依赖核酸序列的扩增(NASBA)、链替代扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)、赖解旋酶恒温基因扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、梯型熔解温度等温扩增(LMTIA)几种主要核酸等温扩增检测技术的发展及其基本原理、特点和在动物源食品检测中的应用,并对几种主要核酸等温扩增检测技术的特点及应用进行比较。

核酸检测技术鉴别转基因食品

转基因作物给农民乃至社会带来巨大的效益,但其安全性备受争议,转基因食品的检测引发了学者的高度重视。重点介绍了几种常用的鉴别转基因食品的核酸检测技术,如基因芯片技术、PCR、环介导等温扩增(Loop-med-iated Isothermal Amplification,LAMP)、重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)、交叉引物等温扩增(Cross Prime Amplification,CPA)。对这些技术的原理、优缺点进行了总结并对其进行展望。提出梯型熔解温度等温扩增(Ladder-Shape Melting Temperature Isothermal Amplification,LMTIA)技术,推进核酸检测技术的研究及在转基因食品检测中的应用。在转基因食品的检测中,RT-PCR,LAMP,LMTIA等均能检出0.01%以下的含量,可用于定量检测,表明这些核酸技术在转基因食品的检测有很好的应用前景。

应用Proofman-LMTIA技术双重检测当归和东当归

通过梯型熔解温度核酸等温扩增技术(Ladder-shape melting temperature nucleic acid isothermal amplification,LMTIA)与校对酶介导探针(Proofreading enzyme-mediated probe cleavage,Proofman)联合的方法对当归和东当归进行双重检测。以ddH2O为阴性模板,当归和东当归基因组DNA为阳性模板,测定当归和东当归引物的最适温度、灵敏度及稳定性,并进行了真实样品检测。结果表明,应用Proofman-LMTIA双重检测当归和东当归,引物测定的最适温度为62℃,当归引物灵敏度低至10 pg/μL,东当归引物灵敏度低至1 pg/μL,具有良好的稳定性。7份市售当归样品经检测均为当归。该研究可为当归和东当归的鉴别提供一种新的检测方法。

核酸检测技术检测肉类种源研究进展

肉及肉制品是人类重要的食物来源,为人体提供必要的营养素。但是以经济为目的的肉制品掺假,是食品安全中屡禁不止的全球性问题。快速、准确、有效的检测技术是有效监督肉类掺假的关键。本文综述了核酸检测技术中热循环扩增技术(如普通PCR、实时PCR、多重PCR)和等温扩增技术如环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术、滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)技术、交叉引物等温扩增(cross prime amplification,CPA)技术等的原理及在肉类种源鉴别中的应用。提出梯型熔解温度等温扩增(ladder-shape melting temperature isothermal amplification,LMTIA)技术,以期推进核酸检测技术的研究及在肉制品领域的应用。在肉类种源的检测中,实时荧光定量PCR技术、跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术等均能检出0.01%的掺伪,可用于定量检测,表明这些核酸技术在肉类种源检测中有很好的应用前景。

LMTIA技术检测HPV核酸的可行性研究

为研究梯型熔解温度等温扩增(LMTIA)技术检测人乳头瘤病毒(HPV)核酸的可行性,分析高危型HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56和HPV58的基因组,选择熔解温度曲线呈梯型的特异性序列,合成特异性序列并克隆到pUC57载体上作为DNA模板,通过设计LMTIA引物、优化反应温度来测定灵敏度.结果表明,所建立的9种HPV高危型病毒LMTIA检测方法在最适温度下稳定性强,对pUC57质粒模板DNA的检测灵敏度为0.1~1 fg/reaction.LMTIA方法稳定性强、灵敏度高,在检测HPV核酸方面具有广阔的应用前景.

肉制品中鸡肉源成分的Proofman-LMTIA方法检测

为建立一种梯型熔解温度等温扩增技术(ladder-shape melting temperature isothermal amplification,LMTIA)结合Proofman探针(proofreading enzyme-mediated probe cleavage)检测肉制品中的鸡肉,选取鸡细胞核中单拷贝且特异性强的prolactin receptor基因为靶基因,设计LMTIA引物和Proofman探针,优化Proofman-LMTIA反应体系,进行特异性、灵敏度和最低检测限测定。结果表明,Proofman-LMTIA方法特异性强,可在30 min内完成检测,检测灵敏度为1 ng/μL,对人工模拟的混合肉样的最低检测限为0.1%。该方法适用于基层单位对肉制品掺假进行快速检测。

Proofman-LMTIA方法检测食品中玉米源基因研究

结合Proofman探针与梯型熔解温度等温扩增技术(LMTIA)建立检测食品中玉米源成分的方法.将玉米转录间隔区(ITS)作为靶序列,在Oligo 7软件上查找熔解温度曲线呈梯型结构的序列,并用Primer 3 Plus软件设计引物,进行温度优化,检测特异性和灵敏度.选择56℃反应条件下,建立的Proofman-LMTIA方法体系的特异性最强,最低检测限为10 pg/μL玉米基因组DNA,可检测质量百分比为0.1%的玉米成分的存在.该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单等优势,适合商业玉米成分快速检测.

犬细小病毒Proofman-LMTIA检测方法

为评价Proofman探针的梯型熔解温度等温扩增技术(LMTIA)检测核酸的性能,以Proofman-LMTIA快速检测犬细小病毒为例,采用实时荧光定量PCR方法和微滴式数字PCR方法进行对比分析。针对犬细小病毒基因的特异性序列设计引物和Proofman探针,通过优化反应条件,对方法的特异性、灵敏度进行测试,再通过实时荧光定量PCR方法、微滴式数字PCR进行对比验证。结果表明,所建立的Proofman-LMTIA方法在最适反应温度为61℃时,与猫、犬等基因组DNA无交叉反应,灵敏度达到8拷贝/μL,且能够在20 min内完成检测,与实时荧光定量PCR和数字PCR方法结果具有一致性。该方法不仅在恒温条件下即可扩增,且具有快速、灵敏、高效等优点,适用于病毒的现场快速检测。